Transgenic животни: на технологијата на

Видео: Bioseminars.ru: Егор Malashichev - transgenic животни и компаративна ембриологија

За разлика од растенијата, каде што постои можност за добивање на плодна растенијата од трансформирана соматски клетки и клонирање, производство на transgenic животни - многу тежок и долготраен процес.

Стратегијата се користи е како што следува:
1. клонирани ген е воведена во оплодената јајце-клетка јадро.
2. оплодена јајце-клетка со егзогените ДНК се имплантираат во форма на женски примачот (од успешното завршување на ембрионот цицачи во други околности невозможно).
3. крварат потомство развиена од вграден јајца кои содржат клонирани ген во сите клетки.
4. кос животни кои носат клонирани ген во клетките на микроб линија и даде нова генетска линија.

Експериментите на генетски модифицирани повеќеклеточни организми со воведување transgenes во нив бара многу време. Сепак, transgenic стане моќна алатка за проучување на молекуларната основа на генската експресија и развој на цицачи, да се создаде модел системи, овозможува проучување на човечките болести, како и генетската модификација на млечните жлезди на животински клетки да произведуваат млечни протеини важни за медицина. Имаше дури и еден роман терминот "pharming» (pharming), кои се однесуваат на процесот на подготовка на млеко од transgenic животни автентични човечки протеини или лекови.

Употребата на млеко е целисходно, бидејќи тоа е формирана во телото на животното во голем број и да nadaivat колку што е потребно, без да му наштети на животните. Произведени од страна на млечните жлезди и се излачува во мајчиното млеко не е роман протеини мора да вложи тоа нема негативни ефекти врз нормалните физиолошки процеси во transgenic животно, и подложен на посттранслациона промена која, барем блиску до оние во човечките клетки. Покрај тоа, нивната изолација од млеко, кое содржи и други протеини, не смее да биде премногу тешко.

И покрај фактот дека првиот transgenic животни се добиени во 1985 година за воведување на егзогените ДНК во pronuclear zygotes сеуште нема развиено ефикасен метод што може да се користи за да се создаде генетски модифицирани животни, без оглед на видот и целта на експериментот. Развој на нови ефективни методи на генот трансфер во ембрионалниот и соматски клетки на животните, како и подобрување на постоечките пристапи е итна задача.

Меѓу голем број на начини на воведување на егзогените ДНК во геномот на животните може да се разликуваат, кои се широко се користат во практиката на transgenic:
- метод microinjection,
- ретровирус-посредувана ген трансфер,
- modifitsirovanngh употреба на ембрионски матични клетки,
- трансфер на трансформираните јадра генеративен и соматски клетки
- употребата на сперматозоидите и сперматогонијата како вектори на ДНК.

Меѓу другите методи на доставување егзогена DNА во еден организам на животни може да се забележи употребата на липозоми, аденовирус вектори, како и начинот на високо-брзински инјекција. Сепак, овие методи не се користат поради нивната недоволна стабилност и недостатокот на интеграција на transgene во геномот.

Microinjection на рекомбинантна ДНК во оплодените ооцити на повеќеклеточни животни се уште е најпопуларниот начин да се воведе странски гени во животни. И покрај фактот дека овој метод бара голема вештина и скапа опрема, едноставност и сигурноста се плаќа сите свои недостатоци.

Првиот и повеќето етаблирано експериментален систем за производство на transgenic животни е на глувчето. Донатор женски глувци со експериментални суперовулација mated со мажи за производство, по 12 часа бил изолиран оплодени јајце-клетки и се става во културата. Понатаму, поголем од двете pronuclei (обично машки) се вбризгува со рекомбинантна ДНК (сл. 2.17). Преживеаните инјектира јајца се трансплантира во форма на женски примачот. Само дел од трансплантирани ооцити продолжи да се развива до calving.

Сл. 2.17. Microinjection на егзогена DNА во pronucleus на оплодената јајце-клетки на цицачи под микроскоп (а) и експериментални подесување (B)

На фреквенцијата на интеграцијата на егзогена DNА со употреба на методот microinjection е под влијание на фактори како што чистотата на вбризгување на примерокот, обликот и концентрација на ДНК, составот на растворот на пуфер за microinjection, квалитетот на ембрионот, и метод на трансфер на ембрионот примачот (нехируршка, хируршки, лапароскопски).

Transgenic животни се идентификувани во потомство на различни методи, повеќето од PCR и споени за да се добие transgenic линии. Некои од transgenic животни мозаик (герминативни клетки не содржат егзогените ДНК) од страна на премин transgenic затоа е помал дел од потомството првата генерација од пресметаната 50%. Во некои случаи, хомозиготни линии не може да се добие, бидејќи на transgenic инсерции 5-15% хомозиготни смртоносна, како вметнување понекогаш ги крши виталните делови на геномот.

Точниот механизам за процесот на интеграција на инјектира ДНК во хромозомите на целните клетки не е позната, но анализата на вметнатата ДНК структури открива одредени точки. Интеграција се јавува по случаен избор на еден хромозомски локус, кој може да содржи еден до неколку илјади тандем копии од интегрираниот ДНК. Околу 30% од основните transgenic животни добиени обично покажуваат одреден степен на мозаикот, кој може да резултира од интеграција на егзогените ДНК репликацијата по првиот циклус.

На степенот на интеграција на егзогена DNА во геномот, т.е. број на transgenic животни од вкупниот број родени животни со примена на методот на microinjection, во зависност од видот варира со мал опсег од 5-15%. Најважните оглед на трошоците потребни за да се произведе еден transgenic животно е transgenic вкупниот индекс ефикасност, која се пресметува како однос на добиените transgenic животно од вкупниот број на трансплантирани ембриони, изразена како процент. Вредноста на овој индекс за цицачи е исто така релативно константна во просек од ~ 0,5% за свињи и крави на околу 2% кај глувците.

Ретровирусна вектори исто така се користат за генерирање на transgenic животни. Инфекција на preimplantation ембриони со рекомбинантна ретровируси - релативно едноставна ефикасна постапка.

Vosmikletochnuyu morula (Сл. 2.18) ослободен од јајце школка и се става во сад култура со фибробласти за производство на рекомбинантен ретровирус. Инфицирани ембриони стигнале до фазата на blastula се имплантираат во pseudopregnant жените. Како резултат на тоа, transgenic организми се генерирани, мозаици во согласност со бројот и локацијата на изградена-in-рекомбинантна ДНК во геномот. Затоа, за да се добие чист редови понатаму бара големи outbreeding.

А недостаток на методот е да се ограничи внесувањето на егзогените ДНК ~ 8 стока за широка потрошувачка, при што transgene може да биде лишен од соседните регулаторни секвенци потребни за изразување, а во некои случаи, се интегрираат во оригинална локус нестабилна.

Новиот лентивирусен вектори (лентивируси припаѓаат на семејството на ретровируси) покажаа многу висока нивната ефикасност во обезбедувањето на ДНК во ооцити и zygotes. Инјектирање на рекомбинантна лентивирусен конструкции во perivitelline простор на свинска zygotes и ооцити говеда резултираше со појавата на потомство со највисок моментов лобуси на transgenic животни. Во исто време, лентивирусен вектори имаат сите недостатоци на вирусните: мала големина вметнување на егзогените ДНК и повеќе интеграцијата во геномот на домаќинот, која може да доведе до несакани ефекти како што активирањето на онкогени и insertional мутагеност. Исто така, лентивирусен вектори за висок степен на мозаик transgenic потомство произведен и поединечни факти замолчување (деактивирање) рекомбинантен лентивирусен секвенците добиени transgenic линии.

Употребата на ретровирусна вектори има еден голем недостаток. Иако овие вектори се создадени така што тие се репликација-дефектен вирус ретровирус геном (помошник вирус) која е неопходна за да се добие големи количини на векторот ДНК може да падне во истите основни како transgene. И покрај сите преземени мерки, ретровирусите помошници може да се повтори и во transgenic животно, што е апсолутно неприфатливо, ако овие животни треба да се користи како храна или како алатка за да се добие комерцијален производ. И бидејќи постојат алтернативни методи на transgenesis, ретровирусна вектори ретко се користи за производство на transgenic животни кои имаат комерцијална вредност.

Сл. 2.18. Шемата за добивање на линии на transgenic глувци користење ретровирусна вектори

На пат е изменета на ембрионски матични клетки може да се користи за да се добие transgenic животни. Клетки изолирани од глувчешки ембриони во фаза на бластоциста, можат да се размножуваат во култура, додека одржување на способноста да се разликува во било кој мобилен видови, вклучувајќи линија клетки микроб, кога се администрира во друга ембрионот во фазата на бластоцисти (Сл. 2.19).

Таквите клетки се наречени плурипотентни ембрионски матични клетки (Шпанија). ES-клетки во културата може да се воведе на целната transgene различни техники (трансфекција, electroporation, вирусните инфекции, итн) без да се наруши нивната pluripotency. Практичната предност на оваа шема е дека тоа му дава одлична можност за избор на клетки со одреден параметар. Ова може да биде бројот на копии од трансгени, нејзината локализација или израз модели.

Познавањето на секвенца околните специфичен сајт за саканиот интеграција, може да Конструирај вектор за вметнување на целната ДНК со хомологна рекомбинација. На пример, да го замени ген кој шифрира лесно да се идентификува индикација за целите на избор со отстранување на неговиот или враќање на функцијата во резултат на transgenic ќелија.

На ист начин, т.н. нокаут глувци (нокаутирам) - глувци со неактивна директно да специфични клеточни гени да учат својата функција. Да изврши хомологна рекомбинација вектор е изградена од таргет ген фрагменти, што е предвидено да ги деактивира дел од таргет ген кој потоа се заменува со избор на маркер за избор на клетки со интегриран дизајн.

Сл. 2.19. Подготовка на transgenic глувци со реконструкција ембрион со помош на генетски модифицирани ембрионски матични клетки (ES-клетки). ES-клетки се добиени од внатрешната клеточна маса на бластоцисти глушец

Избрани transgenic ES-клетки може да биде култивиран и се користи за производство на transgenic животни. Тоа спречува случајно вметнување на трансген, која е карактеристична за начинот и microinjection на ретровирусен вектор системи.

Сите примени под животни шемата мозаици се толку потребни за одгледување работа да се добие чист линии. Примарниот проблем мозаик transgenic животни може да се надмине со пресадување јадра трансформира ES-клетки во enucleated ооцити кои потоа се продолжи нивниот нормален развој. Како резултат на тоа, во секоја клетка на животните добиени ќе содржи transgene.

За жал, плурипотентни ES-клетки, слично на глувчето, додека не се најде во други цицачи и птици, но потрагата продолжува.

Нуклеарна трансфер на трансформираат генеративен и соматски клетки во јајце, или соматски нуклеарна трансфер (соматски трансфер нуклеарна), друг метод што се користи во практиката на transgenesis. Се покажа дека јадрото на ембрионални клетки на различни животни кога префрлени на enucleated јајце понекогаш се во можност да обезбеди развој на нов организам. По кратко одгледување дури и суштината на некои од диференцирани клетки се способни да се обезбеди развој на одржлива поединецот.

На пример, познатиот овцата Доли беше клонирани во 1997 година на спојувањето образован (3-6 пасуси) дојка епителните клетки (вимето) за возрасни животни со шест години без јајце клетката јадро (сл. 2.20). Иако не можеме да ја исклучиме можноста дека клонирање беше случајно земени недиференцирани клетки присутни во епителот на донаторот.

Сл. 2.20. Клонирање на овци по нуклеарна трансфер. На дојка епителни клетки во културата е предизвикана за да влезат во фазата на G0 (фаза на кој јајце). Потоа, спојот на тие клетки со enucleated ооцитот и ембрионите се зголеми на раните фази на ембриогенеза. По што ембрионите се имплантираат во матката на сурогат мајка, која понатамошен развој се одвива. Во експериментот, Ј Вилмут (И. Вилмут) клонирање беше изведена Доли 277 M enucleated јајце клетки со клетки на дојката во фазата на G0 од 29 преживеани ембриони развиена за да се само една одржлива организам

Клонирање на Доли диференцирани клеточното јадро, а другите три овци од ембрионални клетки јадра може да се спроведе преку пренесување на јадра од клетки кои се во фаза на мирување (G0), а можеби и на карактеристиките на ембриогенезата на животните. Кај овците zygotes во првите три дивизии, окупаторската неколку дена, само за да се јавува репликацијата на ДНК, ниту еден од генот не е изразена. Се претпоставува дека во тоа време воведе ДНК е ослободен од клетки специфични регулаторни протеини и соодветните гени се поврзани со развојот на ембрионот ембрионски иницијатор фактори протеини од цитоплазмата на јајце.

Додека клонирање технологии се уште е многу далеку од совршенството - клонирани Доли открива многу знаци на предвремено стареење, тоа е многу ветувачка технологија за производство на transgenic животни. Дури и ако постојат различни проблеми со првата генерација, најверојатно, на втората генерација нема да имаат недостатоци, стекнати преку употреба на "стари" за јадрото на јајце.

Главниот проблем да се реши, со цел да се создаде било transgenic животни со примена на методот нуклеарна трансфер беше вистинска, - е зачувувањето на плурипотентни клетки во континуиран култура. Во моментов се активно бара фактори репрограмирање диференцирани клетки да предизвикаат pluripotency. Ако тоа успее, генетската модификација на овие клетки и создавање на transgenic организми од страна на соматски нуклеарна трансфер ќе стане речиси рутинска процедура, и додека тие се изолирани успешни експерименти.

Вештачки хромозоми како вектор трансген. Повеќето transgenes се cDNA мали гени (<20 тнп) или фрагменты генов. Зачастую кДНК плохо экспрессируются в клетках млекопитающих, а когда трансгеном служит геномная ДНК, важные геноспецифичные регуляторные последовательности, расположенные до и после гена-мишени, обычно не входят в состав вставки. Кроме того, полноразмерные гены и мультигенные комплексы (>100 тнп) слишком велики для встраивания в обычные векторы.

Оглед на сето ова, употребата на челик за transgenic квасец вештачки хромозом (YAC), приближување на фрагменти од геномската ДНК должина од 100 до > 1000 производи за широка потрошувачка и вештачки хромозоми дури и поголем капацитет (околу вештачки хромозоми). Овие епизомална вектори имаат предност - да се избегне позиција на сила генската експресија кога егзогените ДНК. ниво на изразување на вметнатата ген е високо зависна од својата хромозомски позиција, на пример, вградување на неактивни хроматин (хетерохроматин) недопрена хромозом доведува до пасивизирање на ген.

Користење на квасец вештачки хромозоми (YAC), носејќи неколку поврзани гени или голем ген, transgenic глувци беа генерирани од microinjection во pronucleus на оплодената јајце клетка, или трансфекцијата ES-клетки. Transgenic глувци вршење на кластер на пет функционален човечки глобин genovv вкупна должина од околу 250 производи за широка потрошувачка, сите од овие гени се изразени ткиво конкретно и во право време Токму на ист начин како што тоа го прави во луѓето. Усогласеноста беше обезбедена нивната flanking секвенци кои содржат промотор и други регулаторни елементи важно. Користење YAC-transgenic глувци кои се добиени синтетизира само човечки антитела се тетрамерична комплексна структура на два пара на различни полипептидни ланци.

Со хумани вештачки хромозоми (човечки вештачки хромозом -HAC), која ги содржи целиот човечки имуноглобулин место со тешки и лесни ланци се воведени во говеда фибробласти, кои потоа се користи за соматска нуклеарна трансфер. Добиени transkhromosomalnye телиња изразуваат човечки имуноглобулин во нивната крв. Овој систем е важен чекор во насока на производство на животните на терапевтски човечки поликлонални антитела.

Понатамошна опсервација на transgenic животни покажале дека рекомбинантна HACs се одржува во поголемиот дел од првата генерација на поединци во текот на неколку години. Дали можете или не доби вештачки хромозоми да се одделат правилно за време на мејозата и наследна, таа и понатаму останува да се види.

Во поново време, нова ветувачка технологија за животни со гени со посебни потреби - мали мешање РНК (siRNA, siRNA), кои се користат за исклучување на цел гени (замолчување). РНК мешање - конзервативна пост-транскрипциска регулаторниот процес. Двоен-верижна мали мешање siRNA во 19-23 нуклеотиди се врзуваат конкретно на својата комплементарна секвенца на шаблон цел mRNA, насочување заедно деградација на патот.

мешање РНК е дел од ген регулатива системот, имено контроли / потиснува превод на mRNA на ендогени и егзогени вирусна елементи и може да се користи за терапевтски цели. За времена ген исклучување синтетички siRNA се трансфицирани во клетките или почетокот на ембриони. За стабилна ген репресија siRNA секвенца треба да бидат вградени во геномот како дел од изразување ген Конструирај.

Многу ефикасна комбинација на лентивирусен вектори со siRNA за интеграција во геномот. За разлика од класичните нокаут-стратегија која бара долга одгледување линии за да се добие чист неактивна ген и во локуси диплоидни геном siRNA интеграција може лесно да го исклучите цел ген во било кое животно достапни линија.

И покрај широкиот спектар на техники развиена за производство на transgenic животни, до сега нема сигурен и ефикасна технологија за transgenic животни. Најголемите проблеми се поврзани со вметнување на случаен егзогените ДНК во геномот со повеќето постоечки методи. Така што технологијата понатамошно подобрување на квалитетот потребни за развој на видување менување клеточни гени и точно внесување на егзогените ДНК во геномот.

На повеќе од поголемиот дел од геномите на економски важни организми од страна на сега целосно подредуваат и може да се планираат за идната структура на transgenic организмот. Комбинацијата на целосно декодираната геном секвенци со методите на насочени испорака на егзоген ДНК ќе овозможи изградба на transgenic насочени геноми со однапред одредени својства.

NA Воини, TG Volova

Сподели на социјални мрежи:

Слични