GuruHealthInfo.com

Медицинското право: право, документи, одговорности, правила акти.



законот за здравство


Москва, Федерален центар на Државниот санитарен и епидемиолошки Министерството за здравство 2000UtverzhdayuGlavny gosudarstvennyysanitarny vrachRossiyskoy FederatsiiG.G.ONISchENKO24 април 2000 година godaData јули 2000 година vvedeniya1 goda2.3.2. Храна и прехранбени DOBAVKIMEDIKO - Биолошка проценка на прехранбените производи добиени од генетски MODIFITSIROVANNYHISTOCHNIKOVMETODICHESKIE UKAZANIYAMUK 2.3.2.970-001. Развиена од страна на Институтот за исхрана (Tutelian VA -Head, Aksyuk ВО, Васиљев AV, Vorobyev ЛС, VysotskiyV.G., Volgarev МН, Королев АА, Кравченко L . .Во, Maganova NB, Mazo В.К., Pokrovskaya ГР, Sokol'nikov АА, Сорокин EY, TyshkoN.V) -. вакцини и серуми Институтот. II Mechnikov медицински науки (Семенов BF, Britsina МВ, Захарова НС.) - (. GG Onishchenko, Petukhov AI) Ministerstvomzdravoohraneniya RF (Одделение за санитарна инспекција) - Москва-медицинска академија. IM SechenovaMinzdrava Русија (буриња НП, Sukhanov БП.) - Центар"биоинженеринг" РАС (Skryabin KG, Кузнецов BB, Dorokhov ДБ, Asadov УЕ.) - Медицински - Генетски центар на овена (Шишкин СС.) - Москва Државниот универзитет за применети biotehnologiiMinisterstva општо и стручно образование RossiyskoyFederatsii (Rogov IA, малку НГ Gurova N., јазли vv.). 2. Одобрени Април 20, 2000, донесен Glavnymgosudarstvennym санитарен лекар на Руската Федерација од 1 јули 2000g.3. Vpervye.1 воведени. Општи одредби и обемот primeneniya1.1. Методолошки насоки утврдени trebovaniyakprovedeniyu медицински - биолошки студии на прехранбените производи добиени од генетски модифицирани istochnikov.1.2. Упатството е наменето да uchrezhdeniysanitarno - епидемиолошката служба на Руската Федерација, вршење на Државниот санитарен - epidemiologicheskiynadzor, како и други институции акредитирани naprovedenie работа во оваа oblasti.1.3. Барањата на оваа методолошка ukazaniyahv за производи добиени од генетски modifitsirovannyhistochnikov применуваат во фаза на производството, хигиенски прегледи, државата регистрација, набавка, увоз во земјата и realizatsii.1.4. Методолошки упатства се дизајнирани да obespecheniyaedinogo, науката - базиран пристап за оценување на квалитетот на ibezopasnosti прехранбените производи добиени од geneticheskimodifitsirovannyh извори, фазите на развој, испитување на регистрација igosudarstvennoy produktsii.1.5. Производителот на нови прехранбени производи добиени izgeneticheski изменета извори наменети dlyarealizatsii на територијата на Руската Федерација треба да издаде eemarkirovannoy во согласност со утврдените poryadkom.2. Нормативна ssylki2.1. федералниот закон "На санитарно - epidemiologicheskomblagopoluchii населението" од 30 март 1999 година D.2.2. "Основи на законодавството на Руската Федерација за граѓаните ohranezdorovya" од 22 јули 1993 G.2.3. федералниот закон "За измени и дополнувања на Руската Федерација vZakon "заштита на потрошувачите" и KodeksRSFSR за административни прекршоци" на 9 Јануари, 1996 година D.2.4. Правилник за државниот санитарен и епидемиолошки регулатива, одобрени од страна на Руската Федерација PostanovleniemPravitelstva на 5 ју, 1994 N 625.2.5. Правилник за Државниот санитарно-епидемиолошка служба на Руската Федерација, utverzhdennoePostanovleniem руската влада од 30 јули 1998 година. N 680.2.6. Одлука на Главниот државен санитарен Федерација vrachaRossiyskoy N 7 од 6 април 1999 година "За евалуација poryadkegigienicheskoy и регистрација на производството на храна, poluchennoyiz генетски модифицирани извори".3. Услови и opredeleniyaPischevaya производи - храна суровини, храна produktyi komponenty.Prodovolstvennoe нивните суровини - објекти на биолошки, органски и неоргански потекло што се користат dlyaproizvodstva produktov.Pischevoy -produktzhivotnogo прехранбени производи, зеленчук, минерални или биосинтетско потекло, prednaznachennyydlya исхрана на луѓето, и во обем и vpererabotannom vide.Komponent - животински супстанција, зеленчук, микробиолошки ilimineralnogo потекло и p rirodnye sintezirovannyepischevye или адитиви што се користат во подготовка или proizvodstvepischevogo производ или се присутни во крајниот производ во iskhodnomili vide.Kachestvo модифицирана храна - збир на карактеристики кои го одредуваат потрошувачки својства, квалитет на храна ibezopasnost produktsii.Bezopasnost прехранбени производи - не постои опасност dlyazhizni и здравјето на сегашните и иднина pokoleniy.Gennaya факултет - дел од молекуларната генетика поврзани создавање stselenapravlennym во vit0ro нови com Инасио geneticheskogomateriala (рекомбинантна ДНК) способни за репродукција на клетката ifunktsionirovaniyu - hozyaine.Geneticheski модифициран организам - neskolkoorganizmov или организам, било noncellular, едноклеточни или mnogokletochnyeobrazovaniya способен kvosproizvodstvuiliperedachenasledstvennogo генетски материјал различен од prirodnyhorganizmov добиени со користење на генетски инженеринг методи isoderzhaschie генетски - инженеринг материјал, вклучувајќи и гени, фрагменти од него, или комбинација genov.4. Постапката за хигиенски ekspertizyi државата регистрација на прехранбените производи добиени од генетски modifitsirovannyhistochnikov4.1. Сите прехранбени производи добиени од извори geneticheskimodifitsirovannyh поминува хигиенски прегледи poryadke.4.2 Моментално инсталирана. Спроведување на хигиенски прегледи gosudarstvennoyregistratsii и прехранбени производи подготвени од geneticheskimodifitsirovannyh извори се врши според sporyadkom, Руската Федерација постави Резолуција Главните gosudarstvennogosanitarnogo лекар од 7 06/04/99 N "За евалуација poryadkegigienicheskoy и регистрација на производството на храна, poluchennoyiz генетски модифицирани извори".4.3. Организации, компании се во центарот на санитарно-епидемиолошка нормализација, хигиенски сертификација iekspertizy на Министерството за здравство на документи и материјали Руската Federatsiikomplekt, вклучувајќи: - пријава (писмо) да се спроведе хигиенска оценка igosudarstvennoy регистрација на прехранбените производи добиени izgeneticheski изменета istochnikov-- материјали како одраз на медицински - генетски pischevoyproduktsii проценка добиени од генетски модифицирани istochnikov-- материјали одразуваат технолошки skie pischevoyproduktsii својства добиени од генетски модифицирани istochnikov-- материјали одразува медицинска - биолошки pischevoyproduktsii евалуација добиени од генетски модифицирани istochnikov.4.4. Обемот и програма за работа на оценување на квалитетот ibezopasnosti прехранбени производи добиени од geneticheskimodifitsirovannyhistochnikov утврдени со rezultatamekspertizy презентирани materialov.4.5. Работата на оценување на квалитетот и bezopasnostipischevyh производи добиени од генетски modifitsirovannyhistochnikov, фирма - производителот обезбедува примероци од производи, vkolichestve потребно dlyaprovedeniyapolnogoobemaissledovaniy.4.6. Врз основа на испитувањето од imaterialov документи и резултатите на медицинско - генетски, технолошки и медицински - биолошките истражувања produktsiitsentr санитарно - епидемиолошки норми, gigienicheskoysertifikatsii и експертиза руското Министерство за здравство подготвува blankregistratsionnogo сертификат (или образложено мислење obotkaze) и го пренесува на потпис на Одделот gossanepidnadzoraMinzdrava Русија. Регистрација сертификат podpisyvaetsyaGlavnym Државниот санитарен лекар на Руската Федерација, отсуството на AB - Главниот државен санитарен и епидемиолошки Одделот, заменик шеф gosudarstvennogosanitarnogovrachaRossiyskoy Federatsii.5. Медицинско - генетски проценка на прехранбените производи добиени од генетски modifitsirovannyhistochnikovNeobhodimost спроведе било истражување на dannomurazdelu за секој посебен вид на храна, poluchennoyizgeneticheskimodifitsirovannyhistochnikov утврдена од страна на експерт центар "биоинженеринг" Руската академија на науките. Техниките опишани во точките 5.1 - 5.3 се бара priprovedenii медицински - може да се препорача генетски евалуација на прехранбените производи добиени од генетски модифицирани istochnikov- методите дадени во точка 5.4, kakdopolnitelnye.5.1. Rapd genotipovNeobhodimoe анализа опрема и reaktivyOborudovanie и prinadlezhnostiMikrotsentrifuzhnye тип Eppendorf цевки и 1,5 ml од 0,5 (достапен од ДНК-иши РНК-ASE цврста Алфа) тефлон толчник и / или стаклена прачка под razmermikrotsentrifuzhnoy цевки 1.5 ml *>Тип на табелата microfuge Епендорф (тета 20 200000ob. / мин.) *>Автоматска променлива микропипета волумен (Classic / студент 0,5 - 10 mkl- 5 - 40 mkl- 200 - 10000 L) за совети micropipettes (врв "микро" и конвенционални) Фрижидер: (примерок кулер) *>Пловечки Статив - "сплав" probirokVesy microcentrifuge за 0,5 kgMikroanklav - "притисок шпорет"BidistillyatorDNK-колоездач ("На амплитудата-4") Електрофоретскиот опрема поделба DNKv фрагменти од страна на агарозен гел електрофореза: извор на напон за електрофореза (NPC 300) *> и уред за хоризонтална мини - електрофореза (мини-камера) *>UV рефлектор да се визуелизира ДНК електрофореза резултати (transilluminator - UVT) *>SLR фото-тип "зенит" тип портокал svetofiltromFotoplenka "Mikrat-200"(копчето на термостатот"Темо 24-15") Shaker (3D) тип Mikrovstryahivatel цевки вител (тета 2 или 4) *>RN-metrFitotron култивира (Phytotron-99) Табела ламинарен кутија (BL-1) ------------------------------- - *> Ознака на производи, кои се произведени од компанијата"Biokom", Москва, Rossiya.Neobhodimye реагенси и rastvoryReaktivyTris (хидроксиметил) aminometaneHCl konts.EDTANaClSDSAtsetat kaliyaEtilovy алкохол 96% агарозен за elektroforezaBromisty etidiyBornaya kislotaBromfenolovy siniyGlitserinNabor за ДНК амплификација (Biomaster - Srl - Италија - Русија, Москва) Подготовка главната rastvorov1 M Tris pH-7,5 . Растворете 121,1 g TRIS во 800 ml vody.Dovesti pH на саканата вредност со додавање на kontsentrirovannoyHCl и донесе на волумен до 1 литар. A раствор prosterilizovat.0,5 M EDTA pH-8,0. За да се 186,1 g на EDTA додадете 800 ml vody.Dovesti pH вредноста на 8,0 NaOH.5 M NaCl (реагенс одделение или аналитичка чистота). 29.22 g на NaCl растворени во 80 ml вода и се донесе на волумен до 100 ml, prosterilizovat.10 проценти СДС. Растворете 10 g на СДС во 90 ml вода, chtobyuskorit растворање, растворот може да се загрева до 60 степени. C. DovestipH до 7.2 со додавање на неколку капки концентриран HCl idovesti до 100 ml. Предупредување! При мерење на СДС litsomasku се стави на, бидејќи во контакт со мукозата на назофаринксот etotletuchy прав е високо razdrazhenie.Ekstraktsionny пуфер (200 mm Tris-HCl pH-7,5, 250 mM NaCl, 25 mM EDTA, 0,5 проценти СДС). За да се подготви 100 mlekstraktsionnogo пуфер бара 20 ml од 1 m Tris-HCl (pH-7,5), 5 ml M NaCl, 5 ml од 0,5 M EDTA и 5 ml од 10 проценти СДС. Донесе на растворот до 100 vodoyobem ml.5 M калиум ацетат. 49,1 g калиум ацетат растворени во 80 ml на вода за да се донесе на волумен до 100 ml.70 проценти етанол. За да се подготви 100 ml rastvoratrebuetsya 73 ml од 96% етанол и 27 ml vody.TVE 5X пуфер (0,089 M Tris - база bornayakislota 0,089 M, 0.002 M EDTA pH-8,0). До 1 литар од растворот се бара 54 gTris, 27,5 g на борна киселина (аналитички чиста), 4,6 g Na2EDTAx2H20. Dlyaprigotovleniya електрода-0,5X TBE тампон мора да stokovyybufer разредена 10 пати со дестилирана vodoy.Bufer за примена на примерок-6X (0,25-bromfenolovyysiny отсто, 30 отсто глицерол, 10 mM Tris-HCl, 1 мм EDTA). Dlyaprigotovleniya 10 g товари пуфер бара 2,5 mgbromfenolovogo сино, 3 g од глицерол, 0,1 ml на трис, 0.02 ml од 0,5 MEDTA pH-8,0.Rastvor ethidium бромид (10 mg / ml). Растворете 1 gbromistogo ethidium 100 ml вода. За визуелизација на ДНК во раствор agaroznomgele се користи во концентрација од 5 .mu.g / ml. Предупредување! Vsemanipulyatsii со ethidium бромид и растворот на ДНК за да се спроведе vperchatkah.Vydelenie tkaniDlya од растителни ткива производство на растителни семиња, израстоци или drugoyrastitelny материјал germinated под контролирани услови dopolucheniya свежи листови или растение tkani.Vysechku лист добиени од затворањето на капакот tipaEppendorf цевки 1.5 ml или 10 - 14 mg на ткиво (кога vysechkupoluchit тешко) v400mlekstraktsionnogo интензивно хомогенизирана пуфер (потребните решенија и реагенси) со pomoschyuteflonovogo pestika.Primechanie. Да се ​​изолира ДНК е подобро да се земе млади листови smyagkimi ткива без никакви видливи траги на уништување. Тефлон pestikdolzhen се придржуваат до ѕидовите на цевки. Обидете maksimalnominimizirovat време хомогенизација. Хомогенизација доведе dointensivnogo боење зелена екстракција bufera.Probirki со хомогенат се тресат за 5 секунди. на Vortex.Pomestit ultrathermostat цевки и се инкубираат во 65grad. C 15 мин., Содржината периодично се мешајќи probirkimyagkim pokachivaniem.Dobavit во епрувети во 200 .mu.l од 5 m калиум ацетат (претходно ладење во ладилник) содржината на епрувети и tschatelnoperemeshat светлина vstryahivaniem.Inkubirovat примерок во мраз бања за 15 min.Tsentrifugirovat мострата во маса центрифуга на 16.000 g 20мин. на собна temperature.Ostorozhno изберете 400 .mu.l од супернатантот во нови цевки iosadit два тома од 96 проценти етанол (ладење) со мешање нежно. Во овој момент, може да се набљудуваат obrazovaniemalenkoy "медуза" или фино дисперзирани суспензија. Оставете probirkina табела 5 min.Tsentrifugirovat примероци во benchtop центрифугирање на 16.000 g, 10мин. на собна temperature.Osadok ДНК исплакнете ладни на -20 степени. C-70 protsentnymetanolom и центрифугира како што е опишано во претходниот punkte.Rekomenduem повторување на оваа постапка еднаш raz.Slit супернатантот и користење на mikropipetkimaksimalno се отстрани течност остатоци од ДНК probirki.Osadki сува со отворање на капакот probirok.Primechanie. Внимавајте да не overdry ДНК врнежи, на ДНК t.k.peresyhanie доведува до слаба растворливост во vode.Rastvorit ДНК во 100 l стерилни редистилиран концентрација ideionizirovannoy vody.Izmerit DNK.Amplifikatsiya геномски DNKAmplifikatsiyu геномската ДНК се врши во 25 ul реакционата смеса (67 mM Tris-HCl pH-8,8- 16 mm (NH4) 2SO4- 2 mM MgCl2- 0,01% Tween-20- 200 mm секое dNTP- 22:00 / ml 25 praymera- mkggenomnoy ДНК и 0,5 единици. Taq-полимераза) . Сите компоненти со исклучок на ДНК се вклучени во комплетот за амплификација на Biomaster.Sterilnye компанија Eppendorf-цевка тип 0.5 ml и се става vshtativ podpisat.V еден од цевки за да се формира reaktsionnuyusmes секвенцијално додавање на компоненти, како што е наведено во подготвувањето на реакционата смеса primere.Primer + ------------------------------ + ------------------ + -------------- + | Состојки | Во еден примерок, l | На 7 примероци l | + ------------------------------ + ---- -------------- + -------------- + | H2O | 16,8 | 117,6 | + ------------------------------ + ---------- -------- + -------------- + | реакција тампон без | | || MgCl2 (10х) | 2.5 | 17,5 | + ------------------------------ + -------------- ---- -------------- + + | MgCl2 | 1 | 7 | + ------------------------------ + ---------------- - + -------------- + | мешавина dNTP`s | 2 | 14 | + ------------------------------ + ---------------- - + -------------- + | Primer (4 Ау / ml) | 0.5 | 3,5 | + ------------------------------ + -------------- ---- -------------- + + | thermostable ДНК полимераза | 0.2 | 1,4 || (4 U / ml) | | | + ------------------------------ + ----------------- - + -------------- + | ДНК | 2 | - | + ------------------------------ + ---------------- - + + -------------- Разредете на реакционата смеса во соодветните цевки probirkam.Vnesti геномската ДНК и внимателно pipetted dlyaperemeshivaniya proby.Poverh reaktsionnoysmesinasloitneskolkokapelmineralnogo масло (околу 17 .mu.l) да прават отстранување на воздушни меурчиња цевки vtechenie секунди центрифугира во benchtop центрифуга, и штанд perenestiproby DNK.Ustanovit thermocycler и извршете ја следнава програма ДНК засилување: 1 циклус: 94 степени. C - 3 min.- 36 степени. C - 1,5 min.- 72 степени. C-1,5 min.- II.33 циклуси: 94 степени. C - 0,3 min.- 36 степени. C - 72 deg 1,5min.-. C - 1,5 min.- III - 1 циклус: 94 deg. C - 0,3 мин.-36 степени. C - 1,5 min.- 72 степени. C - 10 min.Primechanie. Поради употреба на analizarekomenduem големи chuvstvitelnostiRAPD само еден thermocycler и tolkoodnim избрани сет на реагенси за ДНК засилување. Vsereaktivy за засилување и ДНК препарати мора да се чуваат vmorozilnoy комора на 20 степени. C. refreezing (под -20 grad.C) подготовка на thermostable резултати ДНК полимераза во eeaktivnosti.Elektroforez агарозен гел електрофореза на загуба и визуелизација produktovamplifikatsiiDlya Подготовка 2 проценти агароза потребно да се додаде 1 gagarozy 0,5X TBE пуфер за да се 50 ml и се меша темелно. колба беше затворен folgoy.Kolbu агарозен стави во мини-автоклав или притисок шпорет iavtoklavirovat 15 min.Rasplavlennuyu агарозен се лади до 50 степени. C и се прелива vpodgotovlennuyu гел калап, избегнување на формирање на меури vgele. дебелина гел треба да биде 0,5 - 0,7 sm.Cherez 30 -. 40 минути, кога се формира гел, се отстрани grebenkui да го пренесе на комората за електрофореза, predvaritelnozapolnennuyu TBE тампон 0,5X. На гел треба да биде целосно pokrytbuferom 1 - 2 mm.K 2 ul товари пуфер се додаде 10-13 l reaktsionnoysmesi содржи ДНК засилување производи peremeshatpipetirovaniem и внимателно да се применува на бунари на една агарозен гел. Во екстремни lunkunanesti молекуларна маркер massy.Primechanie. Типично, маркер massyispolzuyut ламбда фаг ДНК молекуларна третирани со ограничување ензим Hind на III или Pst I iEcoR I.Elektroforez изведена на 50 V (5 V / cm) bromfenolovyysiny додека не се достигне ниво од 1 см од работ на гел. Типично elektroforezdlitsya 3-3,5 chasa.Dlya визуелизација на зајакнатата DNA фрагменти gelpomeschayut во раствор ethidium бромид (5 mg / ml) и provodyatokrashivanie за 20 мин. на kachalke.Primechanie. Со решение на ethidium бромид и да ја стартувате во боја gelemneobhodimo perchatkah.Chtoby намали позадина флуоресценција предизвикани bromistymetidiem, гел се мијат два пати со дестилирана вода pripostoyannom pokachivanii.Primechanie. Продолжена миење на гел може да доведе kischeznoveniyu слаби области и ерозија спектарот поради diffuzii.Gel ставен на transilluminator филтер и поглед vprohodyaschem УВ светлина преку заштитен екран и специјални zaschitnyeochki. Доколку е потребно RAPD спектри oranzhevyyili фотографирани низ црвено филтер од типот на филм "Mikrat". Fragmentyamplifitsirovannoy ДНК по третманот со ethidium бромид под УВ budutflyuorestsirovat портокал tsvetom.Primery користејќи анализа RAPD за identifikatsiigenotipov kartofelyaV хартија 19 се користи decameric буквари. компир Spektryamplifitsirovannoy ДНК имаше голем kolichestvofragmentov различни должини. RAPD спектри анализа оценки kartofelyas користење буквар PTA-19 откриени значајни видови polimorfizmmezhdu (сл. 1) *>. Добиените податоци покажуваат некои варијабилност osuschestvennoy сорти intravariety starinnyhotechestvennyh. Користење chislapraymerov ограничени на разни оценки добиени RAPD спектри spetsifichnyedlya посебна класа. Анализа на спектарот овозможува ДНК vyyavitneznachitelnye разлики помеѓу тесно поврзани оценки дури techto се произведува како преку клонирање на клетка варијанти на една идентификација анализа случаи BTEX на zheroditeley.Osnovannaya ДНК може да се користи кога сорти не може да биде сигурно истакнати porezultatam протеини електрофореза, вклучувајќи vsehstadiyah анализа за време на развој на растенијата. развиено брз начин за изолација на ДНК од glazkovkartofelya и RAPD техника за да помогне да се намали времето и stoimostanaliza. Идентификација на сорти ДНК анализа може да се sdelanamenee од 24 ch.Kontrol соматските промени во геномот и пропагира invit0ro трансформира компири на истата буквари dokazalvysokuyu ефикасноста на ДНК анализа за идентификување на genotipovrasteny (сл. 2) *>.-------------------------------- *> Цртежите не се privodyatsya.Zaklyuchenie. Предлог изолација micromethod на геномната ДНК izrastitelnogo материјал за RAPD-анализа е брз, економски, затоа што не бара скапа опрема ireaktivov во споредба со други молекуларни методи otsenkirastitelnyh генотипови, а исто така едноставно да се имплементира. Rastitelnyymaterial може да се земе од областа на стаклена градина и расте vlaboratornyh услови. Ова не се бара micromethod bolshihkolichestv растителни ткива (1 - 20 mg), која е bolshimpreimuschestvom во споредба со други методи, бидејќи фабриката за понатамошна pozvolyaetsohranit raboty.Perechislennyedostoinstva овој метод го прави многу погодни кога се работи со голем број на примероци за масовно анализа и, исто така, priizuchenii индивидуални генотипови rasteniy.5.2. Утврдување дали transgenic DNKv готови производи pitaniyaStandartno opredeleniyanalichiyachuzherodnogo прифатени методи за генетски материјал и неговата анализа производи yavlyayutsyaimmunologichesky и идентификација на transgenic ДНК на pomoschipolimeraznoy верижна реакција (PCR). Оваа студија pischevyhproduktov, произведени со почеток selskohozyaystvennoesyre подложени на термички третман, може да даде immunologicheskiyanaliz нестабилна и слабо vosproizvodimyerezultaty како денатуриран протеини често не се sposobnyvstupat одредена реакција со антитела на мајчин јазик belku.Polimerazno - верижна реакција во оваа смисла има tempreimuschestvom дека термички третман суровини не влијае nakachestvo ДНК како дефиниција и затоа содржани во produktahpitaniya и полуфиналето макс остаток на ДНК суровина priprovedenii PCR дава истите резултати како мајчин јазик критериум DNK.Vtorym да изберете PCR како метод за анализа на сензитивноста на yavlyaetsyavysokaya надминување најмалку dvaporyadka metodov.Pomimo познати имунолошки чувствителноста на PCR е многу помалку скапи и boleestabilnym метод од другите методи на анализа. Odnimnemalovazhnym Друга предност на PCR е дека синтетичките олигонуклеотиди користи vreaktsii ако правилно vyboremogut да се примени за анализа на различни transgenes дека во случај на имунолошки методи nevozmozhno.Metody утврдување дали transgenic DNKv готови прехранбени производи со помош polimeraznoytsepnoy reaktsiiVydelenie produktaV ДНК тест метод е одбран распределба ДНК одлучувачка улога igraetsoderzhanie нафта во прехранбени производи. Со зголемување на soderzhaniimasla (чоколадо, рафинирано растително масло, итн) Дополнителни суспензија nepolyarnyhrastvoriteley екстракција со вода. Ова го прави можно да се пренесе ДНК содржани vpischevom производ во водената фаза, во која за чистење proizvoditsyadalneyshaya. За конечниот техника за чистење ispolzuetsyaoriginalnaya развиена во центарот "биоинженеринг"Конвенционално, должината на PCR фрагмент во идентификување на transgenic ДНК neprevyshaet 1000 базни парови, сепак nizhesleduyuschihmetodik формира основа за постапките за изолација и прочистување за да се poluchitdostatochno чиста ДНК препарати за PCR. техники на земање примероци Vtorymkriteriem беше услов за да се минимизира времето поминато за распределба на еден DNK.Metodika1 дрога. 0,5 g од мострата на храната се хомогенизира со тефлон толчник или pomoschisteklyannogo во 0,5 ml пуфер A (100 mMt0ris-HCl, pH 8,0, 50 mM EDTA, 500 mM NaCl, 10 mm бета-меркаптоетанол) .2. По хомогенизацијата, 100 .mu.l од 20% СДС. Smestschatelno се меша и се инкубираат за 20 - 30 мин. на 65 степени. В.3. Ладење до 4 степени. C, се додава 0,3 ml од 5 M калиум ацетат, предизвика со vortexing и центрифугира за 10 мин. во 15000ob. / мин. во microfuge на собна temperature.4. За да супернатантот е додаден 1 ml од Wizard смола MaxiPreps (Promega, САД) и смесата се инкубираат за 10 мин. на 25 степени. С.5. Потоа, како резултат смеса се пумпа преку мини kolonkuWizard (Promega, САД), се мие со 2 ml од 80 проценти изопропанол, otzhimayutostavshiysyavmini-kolonkeizopropanoltsentrifugirovaniem во microfuge (15.000 вртежи. / Мин., 2 мин.). 6. Microcolumn додаде во 50 .mu.l дестилирана вода загреана на 65 степени. С.7. Инкубираат мини - колона на вода 10 минути. на 65 степени. C, iotzhimayut ДНК раствор во чиста стерилен mikrotsentrifuzhnuyuprobirku центрифугирање во microfuge (15.000 вртежи во минута / мин за 2 мин ...) во зависност од содржината на ДНК на одредена храна одржувањето единица полимераза -. Волумен верижна реакција 50mkl бара од 2 до 20 .mu.l на добиената DNK.Obraztsy подготовка на храна со зголемување на содржината на масло peredvydeleniem ДНК за да биде подложен на дополнителни ekstraktsiiemulsiey хлороформ vode.Dlya од 0,5 g на производот е хомогенизирана smesi0,5 ml пуфер а и 0.5 ml на хлорофилот јаремот 20 и хомогенат се инкубираат min.pri 56 степени. C. Тогаш тоа беше ладен до 4 степени. C и tsentrifugiruyut10 мин. на 15.000 вртежи во минута. / мин. во microfuge на собна temperature.Vodnuyu фаза се собираат и се пренесуваат чиста цевка. Daleeprodolzhayut од чекор 2 metodiki.Vybor претходните прајмери ​​за PTsRDlya прецизно одредување на присуството на transgenic ДНК за да биде обезбедување на компанијата обезбедува информации molekulyarnoystrukture вметнете трансген, имено својата nukleotidnayaposledovatelnost. Ова барање е воведен за да canwas точно да се идентификуваат присуството на одредени geneticheskoykonstruktsii. Во овој случај, синтетички олигонуклеотиди ќе се синтетизира со PCR dlyaprovedeniya така што vyyavitfakt присуство на transgene кодирање регионот. Должина prianalize специфични буквари се користи треба да биде најмалку 25 parnukleotidov да се избегне појава како резултат на реакција производи PTsRnespetsificheskih случај кога nemozhet бидат претставени таквите информации за некои причини (на пример, фирма - процесор моќ proizvoditelproduktov е само proizvodimogodrugoy организација transgenic суровина ) provoditproverku потребни за присуство на секретира производи тестирани DNKnabora стандарден израз касети се користат во m rovoypraktike за да се произведе transgenic растенија. За оние otnosyatsyapraymery да се идентификуваат гени селективно отпор маркер (неомицин отпор ген NPT II и хигромицин HPH), atakzhe стандардно користи области на промоторот (E35S промотор virusatsvetnoy зелка, итн) .Vybor услови на PTsRDlya анализа со користење на стандардни буквари во светот ispolzuyutobscheprinyatye услови PTsR.Dlya случаи на специфични буквари услови избор provedeniyaPTsR се врши за секој случај otdelno.Apparatura применуваат во PCR анализа eerezultatovAnaliz присуство на трансген инсертот на ДНК содржани vproduktah енергија се врши на ДНК thermocycler "Vp-4"произведени "Biocom"Москва. Калење obraztsovosuschestvlyaetsya на сува термостати "термо 24-15" proizvodstvafirmy "Biocom"Москва. За PCR Taq произведени ispolzuetsyatermopolimeraza "Biocom"Москва. Analizproduktov PCR се врши со користење на ограничување анализа etihproduktov со агарозен гел електрофореза и како резултат на моделот на posleduyuschegofotografirovaniya transilluminator фирма UVTIproizvodstva "Biocom"Москва, на филм "Mikrat -Izopan" со помош на камерата "зенит" или во дигитална форма pripomoschi дигитален фото апарат "Кодак DC 120".Fotootpechatki или траги направени на ласерски печатач со резолуција од најмалку 600 точки по инч, мора да бидат приложени kprotokolu на ispytaniy.5.3. PCR идентификација blizkorodstvennyhshtammov bakteriyV присутни техники на молекуларна биологија се базирани naprimenenii полимераза верижна реакција (PCR) се сите boleeshirokoe употреба за дијагностички цели и изрази - analizaraznoobraznogo биолошки материјал. Интензивни методи razvitiepodobnyh се должи на многу висока чувствителност на PCR, можноста за брзи резултати (во odnogorabochego на ден), ниската цена на добиените резултати (во споредба со другите методи) и processability (vozmozhnostyuorganizatsii тековната работна група практично lyubyhusloviyah до мобилни Експрес - лабораторија) .Други молекуларно - биолошки методи или да бараат dlyasvoey realizatsiiorganizatsiispetsialnooborudovannyhdorogostoyaschih лаборатории или да се обезбеди намалување на ultaty со nizkoydostovernostyu.Tipichny пример на неможност за dostovernoyidentifikatsii - филогенетска анализа на тесно поврзани видови ponukleotidnoy 16SpPHK секвенца на ген. Таквите analizyavlyaetsya вообичаено за целосен опис на новооткриената vidovbaktery но дава ниска надежност на popytkerazlichit тесно поврзани видови, како што се случува во индустриски видови sluchaeidentifikatsii St0reptomyces izgruppy B.anthracis.Metod бацили или бактерии идентификација користење PTsRVybor metodaSredi врз основа на употреба на PCR молекуларно - студии biologicheskihmetodov биодиверзитетот најсоодветен за tseleyidentifikatsii бактерии е метод на т.н. DAF-PCR, развиен од страна на Каетано - Annoles (Caetan o - Annoles G, Басам Како Ј, Gresshoff PM (1991) ДНК засилување отпечатоци користење veryshort arbit0rary олигонуклеотид буквари Био / Технологија 9: 553 -556) .. Како и за другите методи, тие или бараат slishkomobshirnoy информации за структурата на геномот на одреден организам (директна детекција на вирус - специфични гени), или да му даде nepolnuyudlya идентификација на тесно поврзани информации видови (RAPD-PCR, DALP-PCR), или премногу сложени и скапи, и не може да bytrekomendovany за широка употреба (AFLP-PCR) .Edinstvennym тесно грло во DAF-PCR е избор на соодветни dlyatochnoy идентификување на краток олигонуклеотид praymerov.Vybor praymerovRazrabotannoe vtsentre "биоинженеринг" РАС programmnoeobespechenie за нуклеотидна секвенца анализа polnyhgenomnyh бактерии дозволува избор oligonukleotidnyhpraymerov за DAF-PCR, обезбедува доверба identifikatsiyubaktery на ниво на вирус, што одговара на individualnymrazlichiyam за луѓето и други високо еукариоти. Таквите rabotaprovedena за идентификација на тесно поврзани бактериски група. anthracis, за кои идентификација користење standartnyhmetodov (филогенетска анализа на нуклеотидни posledovatelnostigena 16SpPHK) беше bezuspeshnoy.Vybor услови на PTsRUsloviya реакција се утврди степенот на резултатите точноста ivosproizvodimosti и треба да се одржи за konkretnoygruppy bakteriy.Sozdanie електронска база на податоци dannyhDlya комплетна и сигурен идентификација на одредени mikroorganizmaneobhodimo создаде електронска база на податоци за одредена gruppebaktery, која вклучува информации за максимална СЗО mozhnomchisle различни достапен како чисти култури или видови kollektsiitipovyh bakteriy.Vydelenie DNKNaibolee значајни резултати во PCR дава ДНК vydelennayaneposredstvenno пред насочување на реакција на zamorozhennoybakterialnoy ставете користење метод Promega компанија смола (САД) pomodifitsirovannomu за контакт и Birnoboyma сооднос: - 20 - 40 ul на одмрзнати бактериски 100mkl маси суспендирани во пуфер I (50 mm t0ris HCl, pH 8,0, 5 mM EDTA, 50 mkg / ml RNAse) .K суспензија се додава 120 .mu.l на лиза пуфер (0,2 M NaOH, 1% СДС) и се очекува бактериска лиза како што се гледа растејќи Виско stisuspenzii. После тоа, бактериски протеини и сложени oblomkovkletochnoy ѕид предизвикана со додавање на 100 .mu.l од 2,55 М ацетат kaliyapri енергични тресење на вител за 5 мин. Zhestkoevstryahivanie vortexed потребно да се porvatdlinnuyu бактериската ДНК која е прикачена за точки на мембраната vneskolkih, инаку паѓа osadokvmeste со SDS-протеински комплекс. Смесата потоа беше центрофугира namikrofuge за 5 - 10 мин. На супернатантот е префрлен на microfuge за mlprobirku 1,5 содржи 0.75 ml на смола "Wizard PCR-првично"или "Волшебникот Мини првично" Компанијата Promega. Смесата се целосно peremeshivayuti се пумпа преку мини-колона, смола беше измиен талогот vmini колона 2 ml од 80% изопропанол, центрифугира во microfuge 1 мин. при максимална брзина за да се отстрани остаток на течни iminikolonku става во стерилен 1.5 ml microfuge цевка, се применува во мали - колона од 50 l редистилиран на стерилна вода и греење ilideionizovannoy цевка колона 5 мин. кога 70grad. C. Потоа на мини - колона во цевка е ставен во microfuge за 1 минута itsentrifugiruyut. на максимална брзина за perenosarastvora ДНК во тест цевка. Опишан метод, од редот на 5 mkgDNK. На големината на резултирачкиот ДНК - од 3 до 15 kb, да се одделат дека vpolnedostatochno 16S РНК на бактерии (околу 1500 bp priispolzovanii на парот прајмери ​​11F / 1492R). Предвидени ispolzovaniyasterilnyh решенија и прибор добиениот ДНК може да се чува на температура од + 4 степени. C во период од шест месеци. Рок на траење на ДНК препарати на 20 степени. C надминува 2 goda.Ispolzuemye реагенси и oborudovaniePTsR osuschestvlyaetsyanaDNKamplifikatorah"Vp-4"произведени "Biocom"Москва. Калење obraztsovosuschestvlyaetsya на сува термостати "термо 24-15" proizvodstvafirmy "Biocom"Москва. За PCR Taq произведени ispolzuetsyatermopolimeraza "Biocom"Москва. Analizproduktov PCR се врши со користење на ограничување анализа etihproduktov со агарозен гел електрофореза и како резултат на моделот на posleduyuschegofotografirovaniya transilluminator фирма UVT1proizvodstva "Biocom"Москва, на филм "Mikrat -"Izopan" со помош на камерата "зенит" или во дигитална форма pripomoschi дигитален фото апарат "Кодак DC 120". Iliottiski фотографски отпечатоци направени со резолуција од ласерски печатач не е menee600 dpi, мора да се примени provedeniyaispytany протокол. Олигонуклеотид буквари се синтетизира во Центарот"биоинженеринг" RAN.5.4. Методи за определување на вкупниот svoystvgeneticheskoy vstavki5.4.1. Изолација на геномска ДНК од страна на полимераза верижна реакција и однесување. Да се ​​изолира геномската ДНК од примерок од фенол на производот mozhetprimenyatsya - хлороформ или друга соодветна метод [124]. Како резултат на ДНК подготовките се чува на температура од минус 70 степени. C iispolzuyutsya за анализа од страна на полимераза верижна реакција (НДП). Олигонуклеотид буквари за PCR може да биде predostavlenyfirmoy - производител на производи или можат да се синтетизираат во согласност со pozakazu vstavki.5.4.2 податоци структура. Во спроведување на PCR користење Taq-ДНК-polimerazaproizvodstva IBCh. Во волумен од 50 .mu.l типичен експерименти polimerizatsionnuyusmes е изградена така што тоа содржи 350 nggenomnoy ДНК, 1,5 мм секоја од chetyrehdezoksiribonukleotidtrifosfatov (компанија МБИ Fermentas Литванија), 1 единица. Taq-полимераза. Потоа, за да на полимеризација мешавина додаде 30pkM пар на прајмери ​​олигонуклеотид во rastvoresleduyuschego пуфер состав: 67 mm Tris-HCl пуфер (pH 8,0 на 25 ° C.), која содржи 16.6 mM амониум сулфат, 67 mm MgCl2, 10 mm 2-меркаптоетанол, 6 , 7 mm EDTA, и говедски серумски албумини vkontsentratsii 170 mcg / ml. Следно, секој примерок се таложеше на 50mkl минерално масло и реакцијата беше врши во согласност со програми специјално прилагодени за сајт-специфичен ген ДНК thermocycler vmnogokanalnom "Termtsik" производство на АД"ДНК технологија" (Москва) .Ако е потребно, можно да се изврши мултиплекс PCR dlyaanaliza неколку значајни vstavki.Produkty засилување фрагменти беа анализирани од страна на електрофореза vplastine 6 проценти полиакриламид гел (2.5 h на 200 V) ДНК-маркери е стандарден сет на ДНК фрагменти plazmidypBR322 добиена под дејството на ограничување ензим Алу 1 (фирма MBIFermentas). Боење на ДНК фрагменти се врши со ethidium бромид. Анализа на резултатите и фотографирање elektroforegrammyosuschestvlyayut во usloviyahultrafioletovoypodsvetkinatransillyuminatore.5.5. Методи на евалуација vstavki5.5.1 операција. Одредување на mRNA произведени од страна на вметнување, во kotorayavvedena на растенијата геном користење на вгнезден PTsR.Vydelenie вкупното mRNA препарати од примероци produktaguanidin - тиоцијанат - фенол - Метод на хлороформ [125] iprovedenie следните гнездење PCR прајмери ​​со декларираната [126, 125]. Откривање на синтетизираниот електрофореза cDNA vpoliakrilamidnom гел од страна на боење со ethidium бромид [126] .5.5.2. Две-димензионални електрофореза анализа belkov.V raboteispolzuyutsyasleduyuschie реагенси: акриламид, метилен bisacrylamide, зрно, трис, глицин, содиум додецил сулфат, амониум persulfate, Тритон X-100, ditiotrietol Amberlite MB-1,2-меркаптоетанол, Coomassie брилијантен син R-250, сино kumassibrilliantovy G-250, Tween-20, 4-хлоро-l-нафтол, bychiysyvorotochny албумин - фирми "Слугинка" (Германија) - Помеѓу 20 - фирми"Мерк" (Германија) ampholines pH 3 - 10, pH 5 - 7, pH 5 - 8, фирми"LKB" (Шведска) .Во kachestveraskhodnyhmaterialovprimenyayutsyatakzhe: нитроцелулоза - фирми "Шлајхер и Schull"(Германија) .Belkovye vsehizuchayuschihsyabiologicheskihmaterialov екстракти подготвени слично со користење на obespecheniyamaksimalnoy solubilize протеини лиза раствор (LR) svysokimsoderzhaniemdenaturiruyuschih агенти - уреа меркаптоетанол (ditiotrietola) и Тритон X-100. LR - 9 Mmocheviny раствор кој содржи 5% 2-меркаптоетанол, 2% Тритон X-100, 2% ampholines 3.5 - 10.When prigotovleniiLRsnachala уреа растворени vdeionizovannoy вода и понатаму прочистен со додавање AmberlitMV-1. По 10 мин. инкубација Amberlite rastvorumocheviny одделени и додаде Тритон X-100, ditiotrietol (или 2-меркаптоетанол), ampholines pH 3 - 10 до екстракција од наведените протеини примероци kontsentratsiy.Pri ткиво беа мелено со ножици ineskolko пати со ладна солена вода. Zatemizmelchennuyu ткиво беше хомогенизирана во стаклени хомогенизатор steflonovym HR толчник a во сооднос од 100 mg во 2 ml ткиво LR itsentrifugiruyut на 700 g за 10 мин. дел на супернатантот содржи solubilized протеини (екстракт) се користи dlyadalneyshey raboty.Dlya анализа на протеини со помош на два-димензионална електрофореза poO`Farrellu - метод, sochetayuschiyfraktsionirovaniebelkovizoelektrofokusirovaniem (pervoenapravlenie) -elektroforezom гел во присуство на СДС [128, 129] .Izoelektrofokusirovanie спроведена во стаклени цевки dlinoy150 mm и внатрешен дијаметар од 3,5 mm. Цевка прилагоди vshtativ, пониски дупки запечатени и филм zalivayutpolimerizatsionnoy мешавина на Parafilm. Да ги собере на полимеризација smesigotovyat следниве реагенси: 1.1. 30 отсто акриламид, 1,6% metilenbisakrilamid.1.2. 20% Тритон X-100.1.3. 10 проценти persulfate ammoniya.1.4. Анодна тампон за Изоелектричната фокусирање: 0.01 Mfosfornaya kislota.1.5. Катодна тампон за Изоелектричната фокусирање: 0.02M NaOH.1.6. Заштитна раствор: 4.5 m уреа раствор кој содржи 1% Тритон X-100- 2,5% меркаптоетанол, 1% ampholines pH 3,5 - 10.1.7. Преносливи пуфер за гел првиот правец - belkovyybufer (.. Види дел 2.2) раствор 1.1- 1.2- 1.6- 1.7 чува на температура од 4 степени. CON за 2 - 3 недели. Други користат svezheprigotovlennymi.Prigotovlenie 20 ml на полимеризација смесата се бара dlyazapolneniya цевки 12, што се врши со мешање на 12 g на уреа, 6,75ml дестилирана вода, 3 ml 1.1 ml 2,25 rastvoraTritona X-100 (20%). Оваа мешавина бил третиран со јонска размена smoloyamberlit MB-1 една, надвор беше филтрира и да го е додаден 225 .mu.l amfolinovpH 3,5 - 10 и 900 .mu.l ampholines pH 5 - 7. Смесата се degassed, пред фрлаат во aneposredstvenno цевка на која е додаден 22,5 и 32,5 mklTEMED l од 10 проценти раствор PSA.Polimerizatsionnuyu мешавина беше воведен во цевка од шприц, zapolnyayatrubki дното до исто ниво за 2 - 3 см под verhnegokraya (висина колона гел 11 cm). Топ vodu.Posle затворање слоевит гел полимеризација на вода во текот на својата poverhnostyuudalyayut цевка и сместен во комората gelelektroforeticheskuyu"Био-рад"Модел 175 (САД). Во долниот комора nalivayutrastvor електролитна резервоар пуфер. примероци цевка за да се анализира се применуваат vobeme 50-150 .mu.l (100 .mu.g протеин). variantefraktsionirovaniya применуваат обем на полу примерокот се зголемува до 250 - 350mkl. Од погоре, на рабовите на цевката се слоевит заштитни раствор 1,7 iverhnyuyu анодните уред комора е исполнет до рамнотежа buferom.Izoelektrofokusirovanie prinapryazhenii врши почнувајќи од 400 V до 200 V.ch, а потоа на napryazhenii1000 V до 5400 V.ch сума вредност, или (ноќно режим) во 210 prinapryazhenii дваесет часа, а потоа еден час 1000 zhesummarnogoznacheniya5400V.ch.Neravnovesnyyvariantizoelektrofokusirovaniya со цел да се спроведе на напон се движат од 400 V.ch SAR 200, а потоа и на 1000V V.ch за вкупно znacheniya1000 - 2500 V.ch .po крајот izoel гел колона ktrofokusirovaniya натопен B5 преносливи ml пуфер (раствор 1.7) 10 мин. кога komnatnoytemperature. Тогаш гелови не се наменети за nemedlennogofraktsionirovaniya во вториот правец ihranyat брзо замрзнати на -20 степени. C до неколку nedel.Dlya вториот фракционирање napravleniiispolzuyutmodifitsirovanny метод Laemmli [130] во плочи со PAAG7,5 градиент - 25% во присуство SDS.Dlya оваа намена, се подготвени следниве решенија, од кои zatemsostavlyayut полимеризација мешавината за да се формираат плочи страница: 2.1. 60 проценти акриламид, 0,8 protsentnyymetilenbisakrilamid.2.2. За одделување на гел пуфер: 1 M Tris-HCl (pH 8,8) .2.3. На пуфер за редење гел: 0.5 M Tris-HCl (pH 6,8) .2.4. 10 проценти додецил natriya.2.5. 10 проценти persulfate ammoniya.2.6. Електроди електрофореза тампон: 0.025 M Tris, глицин 0,192M, 0.1 проценти СДС (pH 8,3) .2.7. Агарозен гел: 1% агарозен раствор со dobavleniem0,125 2,6% bromophenol сино. По готвењето rastvorneobhodimo варени за 5 мин., А пред kazhdymispolzovaniem гел мора rastopit.Rastvor 2,5 подготвени непосредно пред употреба, а остатокот се чува на температура од 4 степени. Второ насока C.Fraktsionirovanie врши vplastinah големина на страница од 160 x 160 x 1 мм со линеарен акриламид gradientomkontsentratsii 7,5 - 25%, во уредот за vertikalnogoelektroforeza. Гел плочи подготвени во стандард steklyannyhkassetah. ПРИМЕР детали употреба etogooborudovaniya претходно објавени [131] Конвенционално, за формирање на паралелни плочи 6 гел концентрација sgradientom акриламид (одделување на гел) 2 A раствор беше подготвен: светло (AA концентрација 7,5%) и висока (% концентрација AA25), 100 ml од секој . Целосната структура на овие решенија е даден vtablitse.TablitsaSOSTAVY разделени и концентриран гел + ----- + ------------------------------- ----------- + --------------- + | Компоненти | одделување на гел | Концентрирајќи || + -------- + ------- + гел || | 25% | 6,5% | | + ------------------------------- + -------- + ------- + --------------- + | IBA-AA 60-0,8% ml | 41,8 | 12,5 | 3,3 | + ------------------------------- + -------- + ---- --- + --------------- + | 1 M t0rIS pH 8,8, ml | 36 | 36 | - | + ------------------------------- + -------- + ------ - + --------------- + | 0,5 М t0rIS pH 6,8, т | - | - | 12,7 | + ------------------------------- + -------- + ---- --- + --------------- + | 10% СДС, т | 1 | 1 | 0,5 | + ------------------------------- + -------- + ---- --- + --------------- + | H2O, т | 20,4 | 49,3 | 33,3 | + ------------------------------- + -------- + ---- --- + --------------- + | TEMED, L | 53 | 53 | 20 | + ------------------------------- + -------- + ------ - + --------------- + | 10% PSA, l | 240 | 240 | 400 | + ------------------------------- + -------- + ---- --- + --------------- + Тешки и лесни решенија се меша со користење smesitelGradient поранешниот модел 395 ("Био-рад", САД) или analogichnoeotechestvennoe опрема, така што да се добие концентрација lineynyygradient акриламид во касети кои postepennozapolnyayutsya со користење на перисталтиката пумпа. Типично, истовремено исполнет плочи 6, која обезбедува висок репродуктивност identichnostihizgotovleniyai poluchennyhrezultatov. По пополнување на полимеризација smesnaslaivayut вода. На полимеризација продолжува за 30 - 40 мин. Zatemvodu отстрани, на површината на гел се избришани со филтер хартија izalivayut раствор формирање редење gel.Dlya подготовка 50 ml на раствор се концентрира gelyaneobhodimo компоненти мешавина е прикажано во Табела prichemkatalizatory (TEMED и PSA) е додаден директно peredzalivkoy гел. На полимеризација е завршена во рок од 30 - 40 min.Udaliv вода на површината на редење гел nakladyvayutgel првиот правец и истури стопена агарозен гел (раствор 2.7). Од работ на секоја плочка е формирана "џеб" dlyananeseniya протеини - маркери. Во рок од 5 мин. агароза gelzatverdevaet, обезбедување на целосен контакт на плоча napravleniyas гел првиот гел, и се става во уред за касета за dlyaelektroforeza.Elektroforez се врши на следниве режим: amperage 30 mA по 200 Vmaksimalnaya plastinumaksimalnoe напон моќност 50 Vt.Elektroforez престанува кога водечките работ на боја dohoditdo пониски одделување на гел .По завршувањето на фракционирање за откривање протеин nagelevyh плочи користење на боење со Coomassie R-250 и азот -kislym serebrom.Okrashivanie протеини со Coomassie R-250 N oestriasis metoduFairbanks од страна на [132] во раствор од 10 отсто оцетна киселина, 25 проценти изопропанол, 0.05 проценти Coomassie R-250.Okrashivanie врши во водена бања за 15 мин. sposleduyuschey за перење Неврзани боја 10 protsentnoyuksusnoy kislotoy.Okrasku азот - сребро се врши во кисела на промена Blum [133] со користење на следниве реагенси: раствор на натриум hyposulfite (Na2S2O3 x 5H2O) - 0,2 g / l-раствор на азот - киселина сребро 200 ml - 0,4 g од сребро -kislogo азот, 150 l формалин-развој на 200 ml раствор: Na2CO3 - 8 g, 4 ml натриум rastvoragiposulfita, 100 .mu.l formalina.Vse silvering процеси при врши на мешалка и vplastikovyh контејнери. На гел по боење со Coomassie R-250otmyvayut боја 10 отсто оцетна киселина за да се svetlogofona. Потоа трипати 20 мин. инкубираат во 25-protsentnomizopropanole Отстранување гел СДС, при што promyvayutdistillirovannoy вода (20 сек.). Понатаму, за 1 мин. gelinkubiruyut во hyposulfite решение и два пати за 20 секунди. otmyvayutv дестилирана вода. Во следниот чекор гел се чуваат vrastvore азот -. Кисело сребро 15 мин, а потоа три пати со 20sec. мијат со дестилирана vodoy.Na завршна фаза на гел беше ставен во земјите во развој решение iokrashivanie престана со миење со вода, гел kogdana веќе се појавуваат нови pyatna.Fotografirovanie гелови спроведени во влажна состојба naplenku висока чувствителност (на пример, Mikrat 300). Гелови dlyahraneniya сушат. За таа цел, тие се дехидрирани во раствор кој содржи 3% глицерол и 50% етанол за 30 мин., Zatemplotno закажани помеѓу два слоја на целофан и се сушат на собна vnatyanutom temperature.5.5.3. Одредување на изразување на производот се вклучени vstavkimetodom immunoblottinga.Dlya provedeniyaimmunoblottinganeobhodimoraspolagatsootvetstvuyuschimi глувчешки антитела против протеинот енкодиран со операција за откривање на vstavkoypolipeptida.Dlya на производот vstavkirekomenduetsya употреба Коњугат анти-глувчето на имуноглобулин"Сигма" на разредување на 1: 1500 или коњугатот се против, immunoglobulinovmyshi "Amersham" разреден 1: 600.Na првата анализа фаза врши electrotransfer на протеините од PAAGna нитроцелулоза филтер цврста "Шлајхер и Schull"(Германија), во согласност со методот на Towbin [135] со користење bufernogorastvora содржи 20 mm Tris, 0.192 M глицин, 20 protsentnyymetanol, 0,1% СДС (pH 8,3 - 8,4). Electromigration се врши за вертикална комора Б посебна компанија electroblotting"BioRad" (САД) (или други слични опрема) privelichine напон 15 - 16 V и струја од 120 - 160 mA techenienochi (12 - 14 часа) .По okonchaniyaelektroperenosa нитроцелулоза filtrpromyvayut во три промени на 0.01M PBS (натриум - фосфатен пуфер, PH7 4) 5 за откривање на min.Dlya префрлен на мембрански филтер на протеини во techenie5 - 10 мин. инкубираат во раствор на боја (0,25% Ponceau-c, 40% раствор на оцетна киселина, 15% метанол). Позадина дамки изми 0,01MPBS.Na последната фаза пред да се врзува monoklonalnyhantitel, филтерот беше измиен во 0.1M PBS, кои содржат 30% од изопропанол (да се отстрани СДС), 3 x 20 мин., А потоа пет пати во 0,01 М 0,01MPBS и PBS-0,05% Tween-20. Sorbtsiyuantitel потисне можно е не-специфични филтер од страна на инкубација во раствор од 1% BSA во 0,01MPBS за 1 час на температура од 37 степени. C (или во текот на ноќта на 4 grad.C). На филтерот беше измиен со 0,01 М PBS пет пати, а потоа 0.1 М PBS-0,05% Tween 20 пет пати. Конечно, тоа се одржува во rastvoresootvetstvuyuschih антитело на инкубација во 0.1 М PBS (разредување избраниот случај vkazhdom). По инкубација со mAbs 0,1MPBS филтер беше измиен 5 пати и 5 пати 0,1 PBS-0,05% твин-20 и се инкубираат со peroksidaznymkonyugatom против глувчето Иг Г за 2 часа на температура од 37 степени. C. По pyatikratnyhpromyvok 0.1 М PBS и 0,1 M PBS-Tween-20 пуфер dlyaokrashivaniya се става филтер (12 mg на 4-хлоро-1-нафтол е растворен во 4 ml етанол, обемот е прилагодена до 20 ml со 0,1 M PBS и додаде директно peredprimeneniem 12 .mu.l од 30 отсто на водород пероксид) се додека не се јасна манифестација ivyderzhivayut zon.5.5.4 обоено. Otsenkabiologicheskiheffektov производ (и) функционирањето на vstavki.5.5.4.1. Semipreparative распределба протеин препарати poslefraktsionirovaniya протеини екстракти две-димензионална elektroforezom.Dlya polucheniyaotdelnyh прочистен протеински preparatovdvumernym summarnyebelkovyeekstrakty фракционирана со електрофореза во стандардни услови опишани погоре. Потоа detektsiyubelkovyh фракции се врши во услови на rastvoromatsetata 4M калиум не-лоцирање. Слично фракции се исечените 20-40, а собраните дела gelevyhplastin гелови пред изолација беше чуваат на 20 степени. Може C.Nekotorye протеини елуира со дифузија. Во etihsluchayah добиени парчиња гелови кои содржат протеин на истото име, е земјата и хомогенизирана во дејонизирана вода, а потоа се елуира chegobelok за 15 - 20 мин. хомогенат gelyavstryahivaniem на магнетна мешалка. По центрифугирање vtechenie 20 мин. на 700 g, супернатантот се собрани sosadkom и постапката се повторува уште два пати. Во комбинација супернатантот (obemokolo 50 ml) беше лиофилизирана, талогот се redissolved во 1 - 2 mldeionizovannoy ладна вода и производство на ослободување од натриум izbytkadodetsilsulfata. Otdelyayuttsentrifugirovaniem талог (15 мин. На 3000 g), која obespechivaetponizhenie концентрација СДС во супернатантот до 0,25% [134]. Потоа otostatka соли и СДС располага дијализа против distillirovannoyvody за 12 часа на температура од 4 степени. poluchayutelektroelyutsiey.Elektroelyutsiyu протеини C.Neelyuiruyuschiesya директно врши во единицата за фирмата "Био-рад" (САД) ilianalogichnom опрема. На првата употреба dializnoymembrany (се испорачува со инструментот) го inkubiryut vtechenie 30 мин. во тампон електрода за електрофореза (rastvor2.6) на температура од 60 степени. C. фрагменти гел soderzhaschieiskomuyu дел се става во чаша цевка е поврзана sdializnoy мембрана и исполнет со електрода пуфер dlyaelektroforeza. Цевката беше поставена во уредот, горните и истури nizhnyuyukameru електрофореза тампон, iprotsess поврзани електроди врши во текот на ноќта во постојана amperage izrascheta 5 mA на цевка и ограничување на напонот. Belokkontsentriruetsya во волумен од околу 400 .mu.l тампон rastvorsobirayut тоа, мембраната беше измиен, и овој раствор се додава дел kosnovnoy. решение на протеини потоа била dialyzed протеини со методот на Брадфорд izmeryayutkontsentratsiyu и liofiliziruyut.V работа за да се утврди razlichnyhrastvorah концентрацијата на протеини со користење на методот Брадфорд [136]. На основа metodalezhit врзување боја Coomassie брилијантен син G-250 sbelkom analizaotbirayut rastvore.Dlya примероци (разредена во sluchaeneobhodimosti) кој содржи 1 - 10 g на протеини во 0.1 ml. До 25 mklobraztsa додаде 25 l раствор на боја содржи 0.05% Coomassie брилијантен син G-250, 5% етанол, 10% ortofosfornoykisloty и апсорпцијата на 594 nm. Belkaopredelyayut концентрација од калибрациона крива конструирани за rastvorabychego серум албумин ("Слугинка".5.5.4.2). Тестирање на биолошките својства на клеточна култура инсерти produktafunktsionirovaniya cheloveka.Dlya потврди биолошките својства на производот funktsionirovaniyavstavki се користи за тестирање - системи базирани на култури на човековите фибробластите postnatalnyhdiploidnyh добиени како што беше претходно опишано [137] .Kultivirovanie клетки се врши во DMEM медиум (произведени од страна на "PanEco", RF) дополнета со 5% серум голем rogatogoskota и 5% човечка крв од папочна врвца серумот (произведени од страна на "PanEco", Руска Федерација), користење или стаклени шишенца Карел, или plastikovyeodnorazovye фирма душеци "costar" (Холандија) или во 96-lunochnyeplanshety фирма "nunc" (Данска). Како органски krasiteleyprimenyayut витална боја, метилен-сино [138] и krasitelGimza [139] (фирма "Мерк"Германија) .На првата фаза е поставена во зависност kolichestvomkletok помеѓу дупка и интензитетот на боење со метиленско сино, dlyachego клетки беа засадени на различни густини во 96-planshetyi добро образован за 1 ден на 37 степени. C. Следна kletkiprizhiznenno обоен за 1 час со метилен-сино, добро vkazhduyu додавање на 25 ul раствор на боја. Потоа валкани kletkidvazhdy се измие со вода и суши во воздух. Густина на материјалот Izmerenieopticheskoy дупка врши на electrophotometer"EFOS 9305" (фирма "EFOS", Русија) на 594 nm. Резултати opredeleniyaopticheskoy густина и износот на носител на добро kletokobrabatyvayut од компјутерска програма "SigmaPlot" ilianalogichnyh компјутер programm.Pri проучување на ефектот од работењето на вметнување на способноста на производот naproliferativnuyu на човековите фибробластите да клетки расте во 96-и плочи, беа додадени различни kolichestvapreparata на протеини и по 4 дена на културата probyokrashivayut метиленско сино како што е опишано погоре. Паралелно vseproby mikroskopiruyut (МБИ-3 Налик adaptirovannyykakinvertirovanny микроскоп со помош на посебен додаток) dlyaotsenki морфолошката состојба на растечка kletok.Pered Гимза боење raznoyplotnosti мобилен суспензија во DMEM медиум со 10% фетусот теле серум vobeme 200 л додадена на бунарите на 96-и плочи. Така pervyyvertikalny број на дупки се контролира, тоа не е zapolnyayutkletochnoy суспензија. Плочките се инкубираат во атмосфера на 5 protsentnogouglekislogo гас на температура од 37 степени. C. По еден ден kletkifiksiruyut додавање на секоја добро 50 .mu.l holodnogosvezheprigotovlennogo 2,5 отсто глутаралдехид. Cherez30 минути. одредување на 4 степени. C беше отстранет од држачот на бунари, lunkidvazhdy мијат со ладна решение Хенк и Giemsa mklkrasitelya наполни 100, специфични обврзувачка за хроматинот разредена 01:50 пред употреба. Kletkiinkubiruyut боја 3 часа на 37 степени. Krasiteludalyayut C. Потоа, бунарите се мијат два пати со решение Хенкс, исполнет 100mkl извлекување раствор (0.1 М NaH2PO4: C2H5OH - 1: 1) iinkubiruyut на собна температура за 15 минути. кога nepreryvnomperemeshivanii. Мерење на апсорпцијата извлекување на фотометар rastvoraprovodyat "EFOS 9305" на бранова должина од 620 nm.6. Евалуација на прехранбени производи, poluchennoyiz генетски модифицирани извори на функционални - технолошки svoystvam6.1. Потребата за било истражување porazdelu 6 се утврдува од страна на експерт на Московската gosudarstvennogouniversiteta применета биотехнологија на Министерството за образование на руски генерал iprofessionalnogo Federatsii.6.2. Животот на човековите organizmaglavenstvuyuschuyu протеин игра улога, па се чини дека vazhnymprosledit, ако тоа не подлежи на никакви промени во protsessegeneticheskoy модификации како mozhetprivesti генетски инженеринг за промена на структурата и функцијата на протеини, протеини chastnostifermentov.Svoystva уникатно поврзани со неговата структура. Osnovnymmetodomissledovaniyastrukturybelkayavlyaetsyametodrentgenostrukturnogoanaliza своите кристали. Сепак, за поголемиот дел од протеините се користат во исхраната податоци за нивните strukturepo неколку непознати причини. Од друга страна, тоа е познато chtostruktura протеини, исто така, ја одредува нивната термодинамички својства, што пак влијае на нивната функционална svoystva.Suschestvuet број методи за мерење термодинамички карактеристики, меѓу кои склопот на метод е калори. Etotmetod ви овозможува да се измери температурата на зависноста на teploemkosti.Iz ​​добиени зависност може да се пресмета dlyanativnoy на топлински капацитет и денатурирани форми на протеин и протеин temperaturudenaturatsii енталпија. На пресметано термодинамички parametrypozvolyayut дефинира составен хидрофобност и konformatsionnuyustabilnost протеини [38 - 40]. Овие карактеристики tesnosvyazany со главните функционални својства [41 - 44] .Metod јон-спарување фази HPLC vobraschennyh овозможува идентификација единица zamenyaminokislotnyh остатоци во макромолекуларниот протеин и незаменлив prisravnitelnom студија протеини [44] .Во процесот на менување на геномот на организмот во него nakaplivayutsyakomponenty, obespechivayuschieegoustoychivost на фактори vneshnimneblagopriyatnym - болести, инсекти - штетници хербицид, итн Во одредени концентрации, овие komponentymogut да биде опасна за здравјето на луѓето, се користи во pischuprodukty произведена со помош на генетски методи inzhenerii.Poetomu во индустриската преработка на суровини како mogutpotrebovatsya промени на веќе постоечката технологија, obespechivayuschieminimalnoe остаток opasnyhdlyazdorovyakomponentov. Ваквите промени во технологијата може да влијае nakachestvennyh индикатори (функционално -tehnologicheskihsvoystvah) протеин препарати произведени од geneticheskimodifitsirovannogosyrya.Krome, predpolagaetsyatselenapravlennoe промени составот на амино киселина протеини извлечени од генетски модифицирана храна производи (на пример, има избалансиран АЦН) да ги подобрат своите pischevoytsennosti. Ова неизбежно ќе резултира со промени во функционални својства на комерцијални -technological протеински препарати iotrazitsya на квалитетот на прехранбените производи, во која oniispolzuyutsya. Ова, пак, може да доведе до промени во neobhodimostivneseniya процеси со користење etipreparaty. Затоа, постојана контрола (мониторинг) на својствата на протеини препарати произведени од храна суровина кога geneticheskimodifitsirovannogo сигурно bezopasnomsoderzhanii компоненти штетни cheloveka.Mikro- протеини и макро-молекули одредува ryadnaibolee важни функционални својства на протеини, како kakrastvorimost, способноста да се стабилизира емулзии и пени форма гелови задржи маст и влага [9 - 13] .Овие функционални својства се директно поврзани skharakteristikami готови прехранбени производи. + ----------------------- + ------------------------- --------------- + | функционални својства | Ефект на карактеристиките на готовиот || | Производ | + ----------------------- + ----------------------- ----------------- + | pH на водена суспензија | карактеристика протеин preparatov- || | Дефинира фундаменталните можност || | Употреба на протеини дрога во || | Одреден тип на производ | + + ----------------------- -------------------- -------------------- + | Растворливост | се користи како примарна pokaza- || | Кажам-квалитетни протеини preparatov- || | Причини реолошките || | Протеини кои содржат храна системи, одржлив || | Нес емулзии стабилизиран со Белгород || | Ком zhirouderzhivayuschuyu способност belko- || | O препарати | + ----------------------- + --------------------- ------------------- + | реолошките | одреди нивото на дрога администрација || воден дисперзии | производ, кој обезбедува бараниот || | Комплекс реолошките својства на готовиот || | Производот влијае гуните на материјалната || | Струи во процесот | + ----------------------- + ------------------- --------------------- + | задржување на водата и | влијае на нивото на воведувањето на производот || zhirouderzhivayuschaya | протеински препарати обезбедување || капацитет | намалување на загубите во процесот || | Преработени (варен и пржен), униформа || | Усогласеност на производите, намалување на брак || | Резултат на поделба на вода и масти, || | Производи, намалување на волуменот | + + ----------------------- -------------------- -------------------- + | критична концентрација | одредува нивото на воведувањето на производот || ција гел | протеин препарати обезбедување || | Потребни комплексни структурни - механички || | ICal својства на готовиот производ | + ----------------------- + ------------------- --------------------- + | Емулзија | определува нивото на воведувањето на производот стабилност || | протеински препарати обезбедување || | Подготовка на стабилна масти емулзии, || | Спречува поделбата на масти во процесот || | Обработка | + ----------------------- + --------------------- ------------------- + моментов, не постои стандардизиран metodyopredeleniya функционални својства и мерење на резултатите dolzhnynosit компаративна природа во однос на лекови ilikommercheskim производи произведени од nemodifitsirovannogopischevogo syrya.Osnovnye методи за утврдување функционални preparatovprivedeny имот во следната табела. -------------------------- + ---------------- + -------- + ------------ + | Индекс | Метод за определување на | книжевна || || извор | + + -------------------------- -------------------- ---- + ------------ + | 1 | 2 | 3 | + + -------------------------- -------------------- ---- + ------------ + | состав Идентификација | хистолошки методи | 51 || производи ||| + ----------------- --------- + ------------------------ + ------------ + | Растворливост | спектрофотометар | 50 | + -------------------------- + ----------------- ------- + ------------ + | задржување на водата | метод центрифугирање | 46 || способност ||| + --------------- ----------- + ------------ + ------------------------ + | стабилност на емулзија | метод центрифугирање | 47 | + -------------------------- + ------------- ----------- + ------------ + | критична концентрација | thermotropic метод | 48 || гел | гел + --------- || ----------------- ------- + ------------------------ + ----- + | Zhirouderzhivayuschaya FPIC Б- | метод центрифугирање | 49 || Nosta ||| + -------------------------- + --------- --------------- + ------------ + | конформациона | microcalorimetry | 38 - 40 || стабилност ||| + ------ -------------------- + ------------------------ + ---- -------- + | идентификација на амино на | јон-спарување HPLC метод | 45 || остатоци ||| + ----------------------- --- + ------------------------ + ------------ + | термодинамички својства | диференцијален метод | 39 || | Скенирање microcalorimeters ||| | Calorimeter || + -------------------------- + ------------------ ------ + ------------ + | Интеграл хидрофобноста | microcalorimetry | 40, 41, 42, || || 43 44 | + -------------------------- + ---------------- -------- + ------------ + | реолошките | Viscometry | 52 || воден дисперзии ||| + ------------- ------------------------ ------------- + ----------- + - + | составот со амино киселина | HPLC | 45 | + -------------------------- + ------------ ------------ + ------------ + | органолептички својства | Qualimetry | 53 || масти: боја, мирис, транспарентност |||| ||| + + -------------------------- ----------------------- - + ------------ + | индекс на рефракција | рефрактометрија | 53 | + -------------------------- + ------------------------ + ------------ + | масти тежина | дензитометрија, | 53 || | Гравиметрија || + -------------------------- + ------------------ ------ + ------------ + | Вискозитет масти | Viscometry | 53 | + --------------------- ----- + ------------------------ + ------------ + | масни - киселина состав | GC | 53 | + -------------------------- + ------------------ ------ + ------------ + | јоден број | volumetry | 53 | + --------------------- ----- + ------------------------ + ------------ + | киселина вредност | volumetry | 53 | + + -------------------------- -------------------- ---- + ------------ + | број на сапонификација | volumetry | 53 | + ----------------------- --- + ------------------------ + ------------ + | температура желатинизација | Viscometry | 54 | | скроб ||| + -------------------------- + ----------------- ------- + ------------ + | големината на скроб зрна | оптички микроскоп | 54 | + ------------- ------------------------ ------------- + ----------- + - + | задржување на водата | гравитацијата | 54 || способност скроб ||| + -------------------------- + ------- ----------------- + ------------ + | реолошки својства | Viscometry | 54 || воден раствор на скроб дисперзии ||| + --- ----------------------- ------------------------ + + - ----------- + | Оток скроб | оптички микроскоп | 54 || зрна ||| + ----------------------- --- + ------------------------ + ------------ + | Критички концентрација на | метод thermotropic | 54 || желатинирање скроб | желатинирање || + -------------------------- + -------------- ---------- + ------------ + | Амилоза содржина и | спектрофотометар | 54 || амилопектин ||| + ----------- --------------- + ------------------------ + ------------ + 7. Вас 
Сподели на социјални мрежи: 

 
Слични
Медицинското право: право, документи, одговорности, правила акти.Медицинското право: право, документи, одговорности, правила акти.
Медицинското право: право, документи, одговорности, правила акти.Медицинското право: право, документи, одговорности, правила акти.
Медицинското право: право, документи, одговорности, правила акти.Медицинското право: право, документи, одговорности, правила акти.
Медицинското право: право, документи, одговорности, правила акти.Медицинското право: право, документи, одговорности, правила акти.
Медицинското право: право, документи, одговорности, правила акти.Медицинското право: право, документи, одговорности, правила акти.
Медицинското право: право, документи, одговорности, правила акти.Медицинското право: право, документи, одговорности, правила акти.
Медицинското право: право, документи, одговорности, правила акти.Медицинското право: право, документи, одговорности, правила акти.
Медицинското право: право, документи, одговорности, правила акти.Медицинското право: право, документи, одговорности, правила акти.
Медицинското право: право, документи, одговорности, правила акти.Медицинското право: право, документи, одговорности, правила акти.
Медицинското право: право, документи, одговорности, правила акти.Медицинското право: право, документи, одговорности, правила акти.
» » » Медицинското право: право, документи, одговорности, правила акти.