Крв радиоимуноесеј (РИА) апликација

Во 1956 година за првпат беа откриени кај пациенти третирани со инсулин, nepretsipitiruyuschie антитела способен за поврзување ¹³¹I-инсулин. Потоа, оваа истражувачка група покажува дека Без етикета инсулин се натпреварува со означени антителото за врзување и тоа дислоцира од имуни комплекси. Потоа, Berson и Yalow разви првиот метод за мерење на ПВР на концентрација на инсулин во серумот, за која се доделува Нобеловата награда. Во овој метод, на инсулин врзан за антитела беше одвоена од Неврзани инсулин од страна на хартија електрофореза. Во исто време, во 1960 година., Grodsky и Forsham опишуваат сличен метод со употреба на РИА ¹³¹I-инсулин, но поделбата на врзани и неврзани хормон, што се користи наместо солење електрофореза.

Огромен придонес за развој на РИА Hales и Randle направени во 1963 година да се одделат на врзаните и неврзан хормон тие се користат анти-y-глобулин, т.н. средно антитела. Овој пристап се базира на работа Skom и TALMADGE, кој во 1958 година покажа дека средно антитела предизвика врнежи од комплекси "антиген-основно антитела." Hales и начинот Randle, наречен "методот на двојно антитела", се покажа како многу сензитивни и специфични од претходните верзии на РИА.

Во 1963 година, Херберт et al. Ние развиена техника за одделување на комплекси "антиген-антитело" од Неврзани антиген со активен јаглен обложени со декстран. Методот се базира на имотот на јаглен декстран мешавина значително моментално апсорбира слободен антиген без врзување со антиген-антитело комплекси. Оваа техника овозможува да се подели на имуни комплекси многу byst7 yardarm од pretsipitatsionnye техники, така што можете да го користите ¹³¹I-антигени со ниска специфична активност означени од страна Хантер и Greenwood.

Видео: Учат цртан филм Winx?

Во исто време Utiger et al. проширен спектар на примена РИА, развивање на Метода за мерење човечки хормон за раст. Подоцна Greenwood et al. спроведува метод на iodination STH, дозволувајќи им да се добие означени хормон со специфична активност на 200 500 MCI / mg (6000-9000 Ci / mmol).

Оваа техника се уште се користи денес. Нејзината суштина лежи во фактот дека изотоп јод (1311 или 1251) во составот на натриум јодид се оксидира со хлорамин Т и во оваа форма заменува еден или повеќе атоми на водород во фенил прстенот на тирозин и хистидин имидазол прстен. По 1 мин, на реакционата смеса се додава средство за редукција, за да се избегне непотребно оштетување на хормон. Забележете дека принципот на оксидативен iodination на протеини е опишан во Hughes 1957 година во понатамошно Мејер Knobil и се развива за мерење на РИА симиан и човечки хормон за раст, назначена со тоа, активиран јаглерод се користи за одделување на неврзан хормон.

Потекло РИА се измери нивото на гонадотропен хормони (во овој случај - LH), развиен во 1966 година, на врз основа на употреба на антитела на човечки CG, бидејќи тоа беше претходно покажа дека овие антитела се поврзе со луѓе и LH. Еден од експериментите во оваа област направи вистинска револуција во имунохемија: CATT et al. Откривме дека антителата се во можност да се придржуваат до дисковите на diazotized полистирен. Така, елиминирање на потребата за поделба на комплекси на антиген-антитело комплекс од страна на врнежи или адсорпција. Подоцна CATT et al. дозна имобилизирани антитело директно со незаситен полистирен во алкална средина. Резултатите од овие студии служи како основа за создавање на ELISA (види. Подолу). Faiman и Рајан за прв пат успеа да добие антисерум да гонадотропин хипофизата - човечки LH. Потоа ПВР за одредување на LH стаорец се развиени.

Развој на РИА да се измери нивото на FSH, како и во случај на LH, да започнат со окото на иднината клинички истражувања. Во 1967 и 1968 година. неколку истражувачки групи известија за нови методи на ПВР за различни форми на човековото FSH. Сите од нив се врз основа на методот на двојно антитела.

Во 1967 година, Арија и Ли за прв пат објави начинот на утврдување на пролактин, врз основа на методот на двојно антитела. Првото мерење на Пролактин нивоа од страна на РИА се спроведени во отсуство на човечки материјал во овци и говеда плазма.

Теоретските основи на ПВР

Првиот методи РИА (на пример, методи за Berson и Yalow или Grodsky и Forsham) беа врз основа на феноменот на компетитивна инхибиција. Оваа појава се состои во фактот дека врзувањето на изотоп-етикета хормон (маркерот антиген) со специфични антитела инхибирана во присуство на необележана хормон (необележана антиген). Феноменот на компетитивна инхибиција може да бидат опишани од страна на две формули: 'означени антиген + антитело комплекс е означен "и" необележана антиген антитело + <-> немеченый комплекс». Таким образом, число молекул меченого гормона, входящих в состав комплексов антиген—антитело, обратно пропорционально исходному числу молекул немеченого гормона в реакционной смеси. Иначе говоря, радиоактивность комплексов, отделенных от несвязавшихся антител и антигенов, будет тем выше, чем ниже была концентрация немеченого гормона.

Типично РИА изведена на 4 или 37 ° C во фосфат-пуфер со рН 7 или 8. Реакцијата може да трае од 2 до 24 часа (во зависност од афинитет на антителото и посакуваното ниво на чувствителност). Имајте на ум дека за автоматизација на анализа и подобрување на методи за производство на антитела значително да се намали времето на реакција. Кога реакцијата мешавина, се воспоставува рамнотежа, антиген-антитело комплекси се одделени со врнежи со средно антитела, антигени и апсорпција на слободен антитела на активен јаглен или врнежите во медиум висока густина, како полиетилен гликол. Ако цврста фаза РИА, инкубација медиум е едноставно отстранат и антиген-антитело комплекси остане на полистирен или други цврста фаза. Во последниот чекор радиоактивност комплекси. Ако хормон е оставено ¹²⁵I или ¹³¹I, со користење контра-зрачење ако на етикетата служи 3H, честички со користење на scintillation контра. концентрација на хормони во примероци се пресметува од калибрациона крива подготвени од мерења во стандардни примероци со познати концентрации на хормонот.

Подготовка на антитела

Поликлонално антитело беше подготвен од страна имунизација РИА антиген (хормон) животни од различни видови, вклучувајќи зајаци, кокошки, заморчиња, патки, овци и кози. За основно антитела (анти-хормон) обично се користат во зајаци и заморчиња за средно антитела (анти-основно) - овци и кози.

Видео: Алергии на куче пудел раса

Постојат многу методи на имунизација, најчестите - инјектирање антиген во footpad, или во регионалните лимфни јазли или слезината. Бидејќи во земјата постојат антигени за кратко време, за сигурен индукција на имунолошка реакција со користење на адјувантна Freund е. Неимуноген антигени на ниска молекуларна тежина (на пр, стероидни хормони) и антигени со ниска имуногеност пред имунизација во прилог на големите молекули или честички (метилиран албумин, феритин, декстран, Сефадекс и m. P.). Имунизација обично се врши во неколку фази со интервали од 2 недели. Обично, по неколку инјекции на титарот на антителата во серумот е рапидно расте. Крв за имунолошкиот серум земени од кариес на срцето или на вените и артериите на уво. Вториот метод најчесто се користат кај зајаци. Како резултат на серумски беше инкубираат 30 минути на температура од 57 ° C до уништи дополнуваат. Потоа, серум се додаде конзерванс за да се спречи растот на бактерии и габи (натриум азид или тимеросалот).

моноклонални антитела

Во 1975 година, Kohler и Milstein развиена фундаментално нови - хибридомата - технологија за производство на антитела. Подоцна, овој развој е добитник на Нобеловата награда. Ние се опише главните елементи на оваа технологија.

Глувци или стаорци се вакцинирани со антиген, како што е хормон. Кога титарот на антитела во серумот добива доволно висока за во имунолошкиот животни од село Zenk изолирани плазма клетки, меѓу кои има клетките - производители на антитела на почетната антиген. Плазма клетки ин витро хибридизиран клетки добиени миелом на животните од ист вид. суспензија на клетката е префрлен во медиум на избор во која само хибридни клетки преживеат, и плазма и Nye миелом клетки загине. Хибриден стојат за еден носител во бунари на хлороводородна медиум механизам за снабдување, каде што тие се поделени и форма хибридоми (овековечени клеточни линии). Меѓу мноштво на хибридоми се избере оние кои произведуваат антитела на саканата антиген и се размножуваат нивната хранлива средина или во перитонеалната празнина на syngeneic глувци. Од pitatelno- средни или асцит течност изолирани антитела. Овие антитела се нарекуваат моноклонални бидејќи тие се произведени од хибридом се потомци на еден плазма клетки. Моноклонални антитела кои произведени од страна на хибридома, препознаваат само една епитоп на антиген. Оваа е основно разликата помеѓу моноклонални антитела од поликлонално антисерум, кои нормално содржи неколку различни антитела против различни детерминанти на антигенот.

Една од важните предности на моноклонално антитело на поликлонални лежи во фактот дека на истиот тип на моноклонални антитела со дефинирани специфичност и афинитет, можат да бидат произведени во било која количина и речиси бесконечна (како бесмртна хибридомата). Спротивно на тоа, составот на антитела на поликлонални антисеруми е многу променлива, што треба да се провери секоја нова серија на антисерум и избор на условите на неговата примена. Така, употребата на моноклонални антитела многу полесно да се стандардизираат РИА и други имунохемиски анализи.

Прв хормони, радио-

Како што веќе рековме, за iodization на протеини хормони најчесто се користи метод предложен од Гринвуд и Хантер. Првично се користи како ознака ¹³¹Јас, туку затоа што на краток полуживот на овој изотоп (8 дена) рокот на траење означен хормон бил мал. Во 1967 година, Вајлд et al. се користи за iodization ¹²⁵I (T_1/2 = 60 дена). Од тогаш, на изотоп се користи за означување секој протеин, а некои не-протеински хормони. Добиени на тој начин означени хормони со специфична активност на 100-250 MCI / mg. Ова е доволно за сигурен откривање на честички во радијација шалтер.

За означување на не-протеински употреба на хормони и други радиоактивни изотопи како што се радијатори честички ³H или ¹⁴C. означени ³H или ¹⁴C стероиди се користат не само во имунохемиски анализа на хормони, но исто така и во основните ендокринолошки студии, на пример да се учат на локализација на стероид рецептори во различни клетки и ткива на експерименталните животни.