Методи за лабораториска дијагноза на хламидијална инфекција во максиларниот синузитис

Видео: otolaryngologist Ponidelko С.Н. (СМ клиника)

I. Tsitoskopichesky метод за откривање на Chlamydia

Тоа сугерира два методи со кои може да се подели во инвазивни и неинвазивни. РЕЗИМЕ Првиот е дека материјалот за проучување е содржината на максиларниот синус, што резултира со игла Kulikovskii пункција кој по центрифугирање беше искористена за да се подготват тестови.

Со вториот метод е како што следува: по назална anemizatsii 0,1% раствор епинефрин и примена анестезија средината регионот на назална премин dikaina 3% раствор на - 0,3 ml, со користење на специјални за еднократна употреба четки врши ограда материјал за време на ротирачки движења помеѓу 10-15 медијалниот површината на средината turbinate и странични назална ѕид во областа на параназалните синуси анастомози. На добиени на тој начин материјал се дистрибуира подеднакво на стаклена плочка, воздухот, сушен и фиксни во ацетон за 10 минути на температура од 4-6 ° C. Подготвени брис може да се чуваат до студија за 2 недели. на температура од 2-6 ° C.

Сликање на Romanovsky-Giemsa. Екс tempore боја разредена со дестилирана вода 1:10. Слајдовите се става во садот Петри на дрвени стапчиња дрога надолу. На просторот меѓу мозочен удар и на дното на чашата е исполнет со боја. Машини за боење се врши за 45 минути. Тогаш стакло измие во вода, сушени со филтер хартија и се разликува во закиселува алкохол (100 ml 96% етанол е додаден 10 капки на глацијална оцетна киселина). По боење подготовките се гледа во светлината микроскоп со помош на објективот на потопување (X90). Во овој случај, цитоплазмата клетки извалкан сина, јадра - во цитоплазматски подмножества кламидија на виолетово-сина се определени како темно сина или розова микроколонии на позадина на сина цитоплазма. Во чекор основното тела на Chlamydia подмножества се обоени розова чекор на почетната клетки во сина боја (Ponidelko SN, 2001). За да се зголеми содржината на информациите на методот морфолошки студии се врши во броење на бројот на неутрофили, лимфоцити и макрофаги во тестови подготвени пред третманот и динамика под влијание на дрога администрира.

II. Метод на директна имунофлуоресценција

Брисеви подготвени од soskobnyh материјали, како и крв тестови прободени со мешавина се зема во работна разредувања поливалентна имуноглобулин флуоресцентни хламидијална и албумин говеда, означени со родамин за спротивставени позадина. Употреба работи разредување на серуми 1 / 20-1 / 40. Слајдовите со материјалот за испитување и се става боја беше ставен во влажна комора во термостат за 30 минути, по што стаклото се отстрани и да се испере опширно во фосфат пуфер (pH 7,2) на магнетна мешалка за 1 час, промена на тампон по 30 минути. На суво тестови се применува една капка на ублажен глицерол (9 ml глицерол и 1 ml фосфатен пуфер), а потоа тие се покриени со капак стакло (Ponidelko SN, 2001). Подготовките се гледа под микроскоп флуоресценција "LUMAM-OUT". Профитабилноста анализа се врши визуелно. Резултатите се сметаат за позитивни, ако во подготовката откриени морфолошки типични кламидија елементи специфични флуоресцентни смарагдно-зелена или жолто-зелена:

Chlamydia ретикуларни клетки (PT) и Chlamydia кластер во цитоплазмата во форма на микроколонии, кои имаат форма на компактен, дифузно обоено формации на различни големини - 0,25-1,5 микрони;
Chlamydia основното тела (ИО) - формирање кои се, главно надвор од клетките, сферични или јајчест облик што има различни обоени обемниот крај во форма на затворен прстен или semiring големина 0,25-0,5 mm;
intercellularly наоѓа вклучување - големи светли зелени точки формирани се блиску еден до друг ЕТ.

III. серолошки методи

Крвен волумен во 2,5-3,0 ml во предмети на гладно земени од кубиталниот вена во центрифуга цевка сува. Цевка со крв со цел подобро да тромб повлекување крвни зрнца се инкубираат на 37 ° C за 40-45 мин. По инкубацијата на цевката се центрифугира 20 мин на 3000 вртежи. / Мин тромб "го опкружуваат", и на цевката беше ставен за 1 час во фрижидер, а потоа, со користење на Pasteur пипета, серумот беше одвоена од талог. Сера биле транспортирани во лабораторија во следните 1,5-2 часа или се чуваат на 4-6 ° C за 1-3 дена. Индивидуалните серумски примероци содржат дозволена во фрижидер на фрижидер на температура од минус 20-40 ° C до сериски студии во период не подолг од 6 месеци.

Најспецифичните и информативни (90%) се смета за реакција на индиректна имунофлуоресценција (RNIF). Детекција на антитела на кламидија само еден серум дури и кога нивното извршување титарот на 1 / 8-1 / 16 може да укажуваат на веројатноста за тековната како хламидијална инфекција и присуството на траги на реакција поврзана со било која хламидијална болест етиологија мигрирале минатата година. Зголемување хламидијална титар на антитела 1 / 64-1 / 256 па дури и повисоки во еден серум на тековната долги и сложени форми на инфекција одразува израстоци граница микроорганизам хуморалниот одговор и соодветните резултати на клинички и епидемиолошки анализи и анамнестички податоци стекнување дијагностичка вредност.

Индиректни техника имунофлуоресценција овозможува идентификација на Chlamydia да се формираат со соодветни тест објекти и титрација на серуми во однос на одредени видови на средства, исто така, го прави возможно да се оцени на содржината на серуми на одделни класи на имуноглобулини во присуство на комерцијални флуоресцентни Иг М, А, Г негативни резултати на серолошките тестови не ја исклучува присуство на акутна или хронична (трајна) хламидијална инфекција (Ponidelko SN, 2001).

Користење RNIF максиларниот синузитис кај пациенти утврди титарот Chlamydia антитела во серумот. Како што се користи антигенски препарати подготвени на тестови на граничи слајдови на микробен суспензии, фиксна за 30 мин со ладна ацетон. Материјалот за суспензии на тест се мешавина од жолчка црево на пиле ембриони или органите на бели глувци инфицирани со C. trachomatis, C. pneumoniae и C. psittaci.

Овие антигенски препарати, којашто има специфичност на ниво на родот, да обезбеди идентификација на Chlamydia антитела (AT) епидемиолошки значајни за сите видови на кламидија. серум тест на разредување на 1: 2 до 1: 256 е да се примени брисеви, стакло, сместени во влажна комора и се инкубираат на 37 ° C за 15-20 мин. По изложувањето, тестот материјал се исплакнат со вода од чешма, а потоа на стакло беше ангажиран во Купот на батеријата со фосфатен пуфер pH 7,2-7,4, а потоа да се исплакнат со дестилирана вода. По сушење на собна температура за да се предизвика тестови земени во работа разредување на зајак имуноглобулин луминисцентните анти-хуман и поставување на стакло во влажна комора, се инкубираат на 37 ° C за 15-20 мин. Потоа боење мешавина е отстранет, стаклото е испран во фосфатен пуфер pH 7,2-7,4 за 10 минути, да се исплакнат со дестилирана вода и суши во воздух.

Микроскопија на валкани подготовките врши со помош на микроскоп флуоресценција. Интензитетот на специфични флуоресценција во формулации беше оценета од страна на конвенционалните chetyrehkrestovoy скала (Ponidelko SN, 2001):

"++++" - светла флуоресценција зелени смарагд околу ИО јасно видливи прозрачна "бандажи";

"+++" - доволно светол флуоресценција жолто-зелена боја, може да се открие периферните "бандажи" во ЕТ;

"++" - слаба флуоресценција, патоген морфолошки откри сосема јасно, но периферните "бандажи" во ЕТ едвај видливи;

"+" - слаба флуоресценција, боја недефиниран морфологија микроскопија противат забележливи лошо.

За дијагностички-значајни титарот на анти-Chlamydia антитела преземе максимална серумска разредување, кој обезбедува специфични боење на не помалку од "++". При оценување на серуми серолошки активност против хламидијална антигени за добивање на дијагностички значајни титри на 1: 8 и повисоко.

IV. Метод на полимераза верижна реакција

Полимераза верижна реакција (PCR) е опишан во 1985 година и стана стандарден метод на ДНК засилување во многу лаборатории за молекуларна биологија. На основа на техниката се направи олигонуклеотиди насочени повторувачки циклуси на синтезата на ДНК што доведува до репликација во витро цел нуклеотидни секвенци. Како резултат на тоа, амплификација може да се случи 1 милијарда копии на целните ДНК, која може да се открие или со гел електрофореза или од страна на хибридизација со специфична сонда, по што следи од страна на откривање на хибриди од страна на анализа за ELISA (ELISA). PCR има висока специфичност видови и чувствителност до 10 молекули на ДНК (Ponidelko SN, 2001).

По собирање на материјал во согласност со горенаведените постапки со помош на специјални четки за еднократна употреба што е ставен во стерилни епрувети, 2 mL (epindorfy) подготвени однапред во (0.9% раствор на натриум хлорид) на пуфер. Материјал за 2 часа или се транспортираат во лабораторија по замрзнување на температура минус 18 ° C се одржува за долго време пред да студијата.

Резултатот од анализата се смета за позитивен ако:

големина ДНК производ во клинички примерок одговара токму на ДНК производ на примерок контрола;
во примерокот кој содржи клинички примерок и внатрешен стандард, се идентификува со специфични ДНК производ на внатрешниот стандард;
во примерокот кој содржи вода (негативна контрола), наместо на клинички примерок, на ДНК производ е откриен.

Резултатот од анализата се смета за негативен ако:

во примерокот кој содржи клинички примерок, на специфични ДНК производи, кои не може да се открие;
PCR резултати во двата контролни примероци специфични ДНК производи не се открие.

Анализата се повтори ако:

во примерок, кој што содржи ДНК контрола, не може да се открие ДНК-специфични производи;
во примерокот со внатрешен стандард-специфични ДНК производи, кои не може да се открие, и откриени од страна на специфични ДНК производ во негативна контрола.

V. метод за култура за изолација на Chlamydia

Изолација на патогенот на клеточни култури (CM), кои претходно биле третирани со различни антиметаболити, е еден од најдобрите методи за кламидија дијагноза, т.н. "златен стандард".

Материјалот се зема како директна метода имунофлуоресценција (ПИФ) стерилни посебни четки. Земени материјал се наоѓа во средна транспорт. Како медиум транспорт е фосфатен пуфер со сахароза, на која се додава пред употреба на топлина неактивиран бовин серум на 4% од вкупната, стрептомицин 50 .mu.g / ml амфотерицин Б 25 mg / ml на медиум. Испорака на материјал во лабораторија се врши (во термос со мраз) во рок од 2 часа по земањето на мострата. Култури врши со користење на клеточна култура ДОО MR2 + + + L929 BHK-21C вештачки ниски отпор. Собереш материјал е ламинат на monolayers на клеточни култури, расте на coverslips, претходно исцедена среден раст. Потоа, на инфицираната клетка култура се сместени во ампули и центрифугира за 1 час на 3000 врт. / Мин, со што се зголемува бројот на интрацелуларната подмножества. По центрифугирање, материјалот се истура во ампули, додаде изолациски медиум "Игла" (Eaglas MEM) со tsiklogeksamidom во концентрација од 2 mg / ml. Цевките се инкубираат во термостат на 37 ° C за 48-72 часа (одговара на времето на циклусот на кламидија), по што coverslips беа отстранети од monolayer со цевки, поставени на стакло слајдови надолу monolayer во канадски балзам и утврдување вклучување патоген. Пред ова, фиксација и боење се врши тестови flyuorestsiiruyuschimi антитела и резултатите оценува по 48-72 часа со ПИФ (со користење на специфични поликлонални и моноклонални антитела). По приемот на негативни резултати произведе ново семе (премин) на материјалот. Инфекција на monolayer и евалуација на резултатите клетка се врши од страна на вообичаените методи.

Начин на дијагностички распределба на хламидија во клеточна култура мора да се користи во текот на целиот период на болеста, со исклучок на периодот на антибиотска терапија и за 2-3 месеци. по него. За контрола на лек со цел да се идентификуваат остварлива кламидија, кои можат да го остварат својот целосен животен циклус, овој метод се користи по 3 месеци. по завршувањето на третманот.

VI. метод за електронска микроскопија

Со цел да се формира дијагностички упорни хламидијална инфекција во методот на максиларниот синузитис користење на електронски микроскоп. Една студија на биопсија материјал назална мукоза и синус. За таа цел, мукозни делови веднаш по оградата се фиксни во 2,5% глутаралдехид -th 0,1 моларен cacodylate пуфер со pH 7,4 за 2-24 часа. По миење три пати во cacodylate тампон dofiksiruyutsya 1% раствор на осмиум тетроксид за 1,5-2 часа. дехидрација се врши во алкохоли на зголемување на концентрациите на лекот за 15-20 минути и смола импрегнација како мешавина со Epona aralditom. Во заклучок, полимеризација се врши во инкубатор за 3 дена. на 37 и 60 ° C. По полимеризација semithin делови беа подготвени за 1 микрон дебели на ultratome LKB-3 (Шведска). Stained парчиња се врши според предложени од страна на C. D. Хемфри, F. E. Pittman (1974), метилен-сино, модрите-2 и основни fuchsin за преглед и анализа од страна на светлосна микроскопија (SN Ponidelko, 2001) метод. Во исто време да се земе фотографии со користење photomicroscope «Opton» (Германија). А потоа се подготви ultrathin делови дебела 3700 ангстреми, е ставен на нивната големина решетката бакар помеѓу 200, а потоа во контраст со заситени 30% раствор на етанол и да доведе цитрат (Рејнолдс). Деловите беа испитани под електронски микроскоп «JEM 100S» (Јапонија) на забрзување напон од 80 kV, со зголемување X5, X10, X30, x50 илјада пати. Фото користи тип филм FT-41p (Русија).

За дијагноза на хламидијална лезии на параназалните синуси е да се користи специјални дијагностички алгоритам.

Основниот принцип на дијагностички пребарување е три-фаза.

Во првата фаза скрининг студија на серумот на пациенти со синузитис за откривање на антитела Chlamydia индикатив на тековен инфекција со ELISA и RNIF и проверка на Chlamydia видови (C. pneumoniae, C. trachomatis, C.psittaci).

Во втората фаза преку ПИФ и PCR се врши директно во дијагнозата на кламидијални фокуси (носната шуплина и параназалните синуси) и периферната крв леукоцити да се воспостави генерализирана инфекција.

Во третата фаза за дијагноза користејќи CM утврди антибиотик агенти чувствителност.

Овој алгоритам е тестиран во истражувањето на 97 пациенти, вклучувајќи ги и оние со хроничен синузитис максиларниот изнесува 28 лица, 39 биле пациенти со рекурентен акутен синузитис максиларниот и 30 - не страдаат од болести на горниот респираторен тракт, и влегол во контролната група. Компаративна informativeness различни лабораториски методи за дијагностицирање на хламидијална инфекција меѓу групите испитаници податоците презентирани во табелата.

Компаративна informativeness различни лабораториски методи за дијагностицирање на хламидијална инфекција во синузитис

метод	хламидијална инфекција
метод	S. pneumoniae	C. trachomatis	C. psittaci	само
фонд	59 (60,7%)
PCR	35 (36%)	8 (8.2%)	-	43 (44,3%)
КМ	31 (31,9%)	11 (11.3%)	-	42 (43,2%)
RNIF	25 (25,7%)	14 (14,4%)	7 (7.2%)	46 (47.3%)

Како што се гледа од податоците прикажани во материјалот од пациентите дијагностицирани со хламидија поликлонално група-специфични анти-Chlamydia антитела во 59 (60,7%) пациенти. Сепак, употребата на други дијагностички техники дозволено за нивна целосна идентификација. Кога ова е поставено приближно еднаква на фреквенцијата на откривање на S. pneumoniae и пациентите C. trachomatis во материјалите на синузитис (PCR - 44,3% CM - 43,2%, RNIF - 40,2%).

Така, резултатите од компаративна студија на методи за дијагностицирање на хламидијална инфекција откри висока фреквенција на откривање на кламидија со максиларниот синузитис, која им овозможува на дефиницијата за "Chlamydia етиологија синузитис" и идентификуваат голем број на клинички карактеристики, карактеристични за оваа група на болести.

"Болест, повреда и тумор максилофацијална"
ед. АК Iordanishvili

Сподели на социјални мрежи:

Слични