Терапија со ефект на гените одговорни за синтеза на протеини актин и срцева дистрофин на развојот на хронична срцева слабост кај пациенти со дилатирана кардиомиопатија миокарден miokardai

DЗа да се разбере механизми на развојот и прогресијата на hronicheskoyserdechnoy слабост (CHF) poslednihlet истражување се фокусира на оценување на придонесот на генетските фактори vrazvitie циркулаторна инсуфициенција. Perspektivnympodhodom Ова се должи на фактот дека е откриен генетски ризик и proiskhoditprognozirovanie компликации на болеста се додека нивните klinicheskihproyavleny [1, 2]. Така, во моментов на молекуларна патогенезата на кардиомиопатија urovnerassmatrivaetsya како proiskhoditnarushenie во процесот на генската експресија, особено mehanizmovpretranslyatsii, превод и posttranslyatsii кој води до izmeneniyufenotipa [2]. Позната работа за да се идентификуваат генетски faktorovrazvitiya CHF кај пациенти со дилатациона кардиомиопатија (ДКП), особено кај овие пациенти открија мутации на различни uchastkahgenov одговорни за синтеза на протеини дистрофин и актин [3, 4,5, 6].
Не постојат објавени извештаи за mutatsiigena дистрофин, и актин кај пациенти со миокарден инфаркт, hotyamozhno претпостави дека ваквата мутација е можно под vliyaniemstressa и неврохормоналниот механизми за активирање.
Во овој поглед, целта на работата беше issledovaniegenov actin и дистрофин кај пациенти со идиопатска дилатациона кардиомиопатија, UY лица со миокарден инфаркт.

Материјали и методи

Во issledovanievklyucheno 130 пациенти, вклучително и 104 мажи и 26 жени, 21 за да се vozrasteot 88 години. Пациентите биле поделени во три групи: 1 group- macrofocal и пациенти со акутен трансмурален миокарден инфаркт, комплицирани CHF II - IV ФК од NYHA, 2 група - со миокарден miokardabez клинички знаци на срцева слабост, 3 group- пациенти со идиопатска дилатациона кардиомиопатија CHF II - IV FC. Kontrolyasostavilo група од 30 лица, меѓу кои 21 мажи и 9 жени, vozrasteot 25 за да се 76 години (средна возраст од 55,5 години) без кардиоваскуларни sosudistoypatologii и без тешки хронични болести.
Клинички и демографски карактеристики bolnyhpredstavlena маса.
Проучување на гените на актин и дистрофин proizvodilosv Институтот за генералниот генетика, лабораториски и radiatsionnoygenetiki животната средина Институтот за биологија РАС ген.
tselnayakrov беше искористена за екстракција на ДНК, се направени во епрувета со EDTA со финална концентрација 50mMili цитрат со финална концентрација од 0,5%. Изолација на ДНК provodilis со помош на "DiatomTMDNA првично 200" комплет реагенс (произведени од страна на "Biokom"). Основа на изолација на ДНК со користење на овој naboralezhit употреба на lysing реагенс на ДНК guanidintiotsionatomi цврста "Nucleos". Во присуство на високи концентрации guanidintiotsionata (4M) ДНК adsorbed на активна површина на честички "Nucleos", а останатите крвни компоненти остануваат во медиум, кој е тогаш udalyayutsyatsentrifugirovaniem. ДНК измиен spirtosolevym пуфер zatemsmyvaetsya extragenic цврста со мешавина на јонски разменувач и за поставување на napryamuyuispolzuetsya полимераза верижна реакција (PCR) изолирање на ДНК од цела крв спроведена во согласност со сет instruktsieyispolzovannogo "DiatomTMDNA првично 200" фирма "Biokom".
За откривање на мутации во методот на генот kardioaktinaispolzovali на PCR-RFLP, PCR производот при што rezhetsyasootvetstvuyuschey ограничување ензим, го препознава точка од интерес nukleotidnuyuzamenu. Со ограничување ензим Bcl I ограничување страница (-TGATCA-) vyyavlyaetmissens мутација G (норма) A (мутација) се раствора во 5-егзон ген kardioaktina поврзани со идиопатска дилатирана кардиомиопатија. Sintezpraymerov за истражување на 5-ти ексон беше kardioaktina држи синтисајзер ЈП применета Biosystems (САД). Состав прајмери: F 5 / -gactcgttcccaggtatg R 5 / -gatctcccactcacaaaag.
PCR амплификација се врши на следниот начин rezhimeamplifikatsii: 950S - 40, 580S - 30, 740S - 40 за да се 30 циклуси.
На големината на засилена фрагмент 222 parynukleotidov. Конечни концентрации на PCR реакција мешавина: 67 mMTris HCl в pH = 8,8, 16 mm (NH₄)₂ПА₄, 0,01% Tween 20,1 единици. Taq.polimerazy, 200mm dNTP секоја од нив, 0,5 mm на секоја прајмер 10-20ng ДНК истрага, 1,5 mm MgCl₂,завршно обемот на PCR смеса се додаваат 30 ml.
Да се ​​анализира засилување Резултати 10 mklPTsR производ е се применува на агарозен гел електрофореза на 2%. vgele ДНК развиени со ethidium бромид под УВ светлина на бранова должина од 32nm. По визуелни рејтингот PCR концентрација производ opredelyaliobem PCR мешавина потребни за поставување на ограничување реакција (5 до 10 литри на PCR мешавина).

Истражувањето на генот за дистрофин

За obnaruzheniyamutatsii во дистрофин ген користење на PCR метод со sikvensspetsificheskimipraymerami (PCR-SSP), при што ispolzuetsyapara за PCR прајмери, еден од кој содржи еден или два tochechnyezameny. Еден од замена е интересна замена tochechnuyunukleotidnuyu. На принципот на методот е дека температурата prioptimalnoy annealed прајмери ​​во отсуство на мутација се појавува специфичен опсег на PCR производот, а во случај mutatsiipri на истата температура и изпичам прајмери ​​amplifikatsiine средствата реакција. Одбрани два пара sikvensspetsificheskih praymerovprednaznacheny да се открие missense мутација на А до G во 9 ekzonegena дистрофин на нормална секвенца и sootvetstvennosvyazannaya мутација со Х-поврзана идиопатска дилатирана кардиомиопатија.
Синтеза на буквари за истражување на 5-ти ekzonakardioaktina беше изведена на синтетизаторот ЈП применета Biosystems (САД).
Состав на прајмер: DN 5-GTA AAT ГТТ GAC aga cctgtg 5-GAA CCT CTC ТЦГ CAG ATC ACG Dm 5-GTA AAT ГТТ GAC aga cctgtg 5-GGA TCC TCT CTC GCA Gat СГС на
PCR амплификација се врши на следниот начин rezhimeamplifikatsii: 950S - 40 s, 560C - 30, 740S - 40 за 35 циклуси.
На големината на засилена фрагмент 160 parnukleotidov. Конечни концентрации на PCR реакција мешавина: 67 mMTris HCl в pH = 8,8- 16 mm (NH₄)₂ПА₄, 0,01% Tween 20,1 единици. Taq полимераза, 200mm dNTP секоја од нив, 0,5 mm на секоја прајмер 10-20ng ДНК истрага, 1,5 mm MgCl₂,завршно обемот на PCR смеса се додаваат 30 ml.
Маса. Клинички и демографските карактеристики на пациентите.

Да се ​​анализира rezultatovamplifikatsii 10 ul на PCR производ е се применува на 2,5% агарозен гел покажа elektroforez.DNK гел со ethidium бромид под УВ светлина долг volny320 nm.
За откривање на мутации во issleduemyhprobah снимен amplifitsirovannogofragmenta присуството или отсуството на соодветен пар на буквари:
1. присуство на PCR фрагмент од 160 пара nukleotidovpri засилување на парот прајмери ​​за нормална posledovatelnostiukazyvaet на норма.
2. отсуство на PCR фрагмент со 160 parnukleotidov засилување на парот прајмери ​​за normalnoyposledovatelnosti укажува на присуство на наменет мутација.
3. присуство на PCR фрагмент од 160 пара nukleotidovpri засилување на парот прајмери ​​за mutatsieypodtverzhdaet секвенца со мутација.

Резултати и дискусија

Како што рековме, во литературата постојат извештаи за мутација на генот iaktina дистрофин кај пациенти со коронарна срцева болест, особено sinfarktom инфаркт, иако под влијание на neurohormones и други biologicheskiaktivnyh супстанции, кои се активираат како одговор на povrezhdenieserdechnoy мускулите (во овој случај, миокарден инфаркт), vozmozhnopredpolozhit слични мутација. Сепак, и покрај условите на pravilnyeteoreticheskie и нашите очекувања, се пронајдени мутација на гените на пациенти изучува. Згора на тоа не, opredelyalasmutatsiya и кај пациенти со дилатациона кардиомиопатија, иако во последниве години во истражување rezultateryada добијат доволно значајни резултати, поради kotoryekasayutsya дистрофин генетска мутација и актин со срцето nedostatochnostyu.V особено, Р. Ортиз Лопез и сор. [2] истрага genomnuyuDNK 3 семејства кои не се поврзани со Х-поврзана дилатирана кардиомиопатија.Контролната група се состоеше од 50 женски лица и 50 машки neyavlyayuschihsya роднини. За амплификација на ДНК беше искористена PTSR.V резултат на студијата во една од семејства со Х-поврзан DKMPbyla идентификувани генетска мутација кодирање дистрофин lokalizuyuschegosyav хромозом 21, особено, се најде замена на аденин guaninv ексон 9 на позиција 1043, што доведе до синтеза на хидрофобни nepolyarnoyaminokisloty аланин, наместо на хидрофилна поларна треонин присутни во дистрофин во позиција 279, во врска со kN-завршетокот на протеини дистрофин на. Замена на треонин со аланин izmeneniyupolyarnosti води кон N-завршетокот на протеинот а со тоа и промена vtorichnoyi дистрофин високото структура. Така, оваа mutatsiyayavlyaetsya да предизвика губење на стабилизирање на мембраната нарушувања функција etogobelka и функционална активност на кардиомиоцитите, chtoi доведува до X-поврзани дегенеративни болести miokarda- X-поврзани дилатациона кардиомиопатија.
F. Muntoni et al. [4], и Milasini Ј et al. [5] се опишани мутации во други сајтови distrofina.Eti ген делови биле испитани Р. Ортиз Лопез-et al. [3] tehzhe 3 семејства со Х-врзана дилатациона кардиомиопатија, мутациите во овие сајтови беа vyyavlenone. Како резултат на тоа, ние може да се мисли на различни механизми veduschihk развој distrofinopaties.
Така, секоја мутација distrofinaprivodit на недостаток на миокарден протеин кој yavlyaetsyaprichinoy отсуство на миокарден гликопротеини distrofinassotsiirovannyh [7, 8] одговорен за врзување комплекс multiproteinnogo sbelkami екстрацелуларниот матрикс. Како резултат на ова yavlyaetsyadezorganizatsiya кардиомиоцитите, што доведува до промена во mehanicheskoymodeli инфаркт, нарушување на неговата пумпна функција и срцева слабост.
Што се однесува до мутација на срцеви актин, другар во 1998 година го објави својот труд Т. Олсон et al. [6] демонстрира со студии на две неповрзани semeys автозомно доминантна идиопатска кардиомиопатија (еден semyanemetskogo потекло, вториот - шведско-Norwegian). За vsehchlenov врши ехокардиографија, biopsiyamiokarda, DCM идентификуваат карактеристични одлики (фокусна interstitsialnyyfibroz и cardiomyocyte хипертрофија). За детекција на генетски мутации актин PCR се користи. две единствен ген mutatsiietogo идентификувани: едно - во генот 5-ти егзон kardioaktina (за замена на guaninana аденин, што доведува до кодирање синтеза на хистидин во 312 mpolozhenii наместо на аргинин), а другиот - на 6-ти егзон (замена adeninana гванин, што резултира појави синтеза 361-та положба на глутамин glitsinavmesto). Но, може овие промени се смета vramkah kardioaktina ген полиморфизам. За да се исклучи како predpolozheniyaprotestirovany 435 неповрзани луѓе опишани мутација не им беше vyyavlenou. Затоа, овие олицетворение assotsiiruyutsyaimenno актин ген со идиопатска дилатирана кардиомиопатија.
Фактот дека нашата работа не може да се открие mutatsiyagenov actin и дистрофин не е директна изјава дека мутацијата не. Можеби мутација случува vbolee подоцнежните фази на болеста? Треба да се напомене дека во nashemissledovanii не спроведе генетска анализа во семејства со idiopaticheskoyDKMP и неповрзани лица биле однесени. Веројатно за glubokihvyvodov, исто така, треба голема популација во однос issledovanie.I не може да биде помалку значајни гени студија drugihstrukturnyh компоненти на срцевиот мускул, особено kollagenai еластин мутација која може да има вредност во razvitiiHSN.

референци:
1. Tereschenko SN Clinicopathogenetic генетски аспекти на хронична срцева слабост ivozmozhnosti корекција на дрога. / Diss. ... д-р мед. nauk.- М. 1998 287.
2. Bristow M.R. Зошто миокардот не? Увид од основните науки. // Lancet 1998- 352: 8-14.
3. Ортиз Лопез Р. Х. Ли, Су Ј, Goytia В., Towbin J.A. Доказ за дистрофин missensemutation како причина за X-поврзани дилатациона кардиомиопатија. // Circulation1997- 95: 2434-40.
4. Muntoni F., Cau М., Ganau А., Congiu R., Arvedi Г., Mateddu А., Marrosu M.G., Чанкети C., Realdi G., Као А., Melis M.A. Краток извештај: бришење на дистрофин мускулите promoterregion поврзани со Х-врзана дилатациона кардиомиопатија. // N.Engl. Ј Med 1993- 329: 921-5.
5. Milasin Ј, Muntoni Ф., Severini ГМ, BartoloniL., Vatta М., Kraoinovic М., Mateddu А., Angelini В., CameriniF., Falaschi А., Mestroni Л., Giacca М и HMD истражувачка група . Apoint мутација во 5` сплетка сајт на генот за дистрофин firstintron одговорен за X-поврзани проширени cardiomyopathy.// Hum.Mol. Женет. 1996- 5: 73-9.
6. Олсон T.M., Михелс V.V., Thibodeau СН, Таи Y.S., Китинг M.T. Актин мутации во дилатациона кардиомиопатија, на наследни форма на срцева слабост. // наука. 1998- 280: 750-2.
7. Bies R.D., Маеда М., Roberds S.L., HolderE., Bohlmeyer Т., Young J.B., Кембел K.P. A 5` дистрофин duplicationmutation предизвикува мембрана недостаток на алфа-dystroglycan во afamily со X-поврзан кардиомиопатија. // Ј Мол. Ќелија. Cardiol.1997- 29: 3175-88.
8. Франц W.M., Кремер М., Херман Р., GrunigE., Фогел В., Scheffold Т., Goebel H.H., Kircheisen Р., KublerW., Voit Т. et al. X-поврзана дилатирана кардиомиопатија. Роман mutationof генот за дистрофин. // Ен NY Акад. Сци. 1995- 752: 470-91.