Хематологија ефекти на новата активност на мутираниот p53 во клеточниот циклус, апоптоза и чувствителност на цитостатици

Повреди на функцијата на p53 се повеќето разноврсна во различни тумори molekulyarnymizmeneniem лице. Тие можат да voznikatlibo дури и во нормалните клетки и на тој начин се зголемува veroyatnostobrazovaniya неопластични клон на тоа, или да биде uzhev туморските клетки и да се утврди понатамошен напредок novoobrazovaniya.Sleduet нагласи дека со промена kletochnogotsikla контролни пунктови на регулативата и апоптоза, p53 дисфункција менувате chuvstvitelnostkletok на антиканцерогени лекови.

Како по правило, во туморите откри missense мутации на p53, privodyaschiek една аминокиселина е заменет со друг, и со најголема chastotoymutatsii пронајдени во три "жаришта": Kodonah175, 248 и 273. Веројатно, изразот на мутираниот p53 придава kletkedopolnitelnye селективна предност во однос на клетките во која се менува во p53 генот доведуваат до загуба ekspressiipovrezhdennogo алел на. Овој факт може да се објасни со krayneymere две причини. Прво, мутираниот протеин има доминантна negativnymeffektom против див тип на протеин, т.е. mutatsiyadazhe точка во еден од двата алели е во состојба да се потисне целосно ohrannuyufunktsiyu p53. Второ, во последниве години има податоци укажуваат на постоење на мутантни форми на p53 стекнатите активности ("стекнат на функција"). Познато е, на пример, дека за schettakih активности на мутираниот p53 може конкретно и со vysokoyaffinnostyu врзуваат MAR / SAR ДНК-елементи, предизвикувајќи remodelirovaniehromatina, транс-активира промотори на неколку гени (онкоген myc, епидермален на рецепторот на факторот на раст и др.) И uvelichivatmetastatichesky потенцијал клетките на туморот. Сепак molekulyarnyeosnovy стекнатите активности и нивната улога не е практично бил испитуван во kantserogenezapoka процеси.

Ние се обидовме да се испита влијанието на ново priobretennyhaktivnostey мутираниот p53 на регулацијата на клеточниот циклус, apoptozai чувствителност на цитостатици. За да го направите ова, ние се проучени effektymutantnyh замени p53 амино киселина во кодони 175, 248 ili273 се "жаришта" razlichnyhopuholyah мутации кај луѓето. нови мутираниот p53 активност беше откриен од страна трансдукција во култивирани клетки ин витро без produtsiruyuschieendogenny p53. Употребата на клетки недостасува p53 ekspressiyaendogennogo, е можно да се елиминира постоењето на доминантна-negativnogoeffekta и следење на ефектот на стекнатите само aktivnosteytransdutsirovannogo мутираниот p53.

Ние ја имаат добиено и деривати на човечки клетки анализирани myshii конститутивен или тетрациклин-repressible ekspressieyekzogennogo p53. Во вториот случај, експресијата на мутираниот r53podavlyalas додавање на тетрациклин во медиумот на културата (1mkg / ml). 24-48 часа по subliniykletok на контакти за пренос добиени во медиум без индукција на тетрациклин забележано ekspressiiekzogennogo мутираниот p53 не е придружено со зголемување на ekspressiigenov цел див тип на p53 (p21WAF1 et al.).

Влијанието на новите активности на мутираниот p53 во клеточниот циклус на стапката на клеточната пролиферација

Новопридобитите мутираниот p53 активност предизвикува suschestvennoeuvelichenie стапка на размножување на клетките. Така, воведување на векторот конститутивно изразување на мутираниот p53-His175, povyshaetskorost репродукција на p53-негативни глувчешки фибробласти linii10 (3) е околу 1,5 :. се намали од 23.5 часа до 16 часа во логаритамска фаза на растење е забележано население на клетката vremyaudvoeniya Shodnayakartina во случај на тетрациклин-регулирани ekspressiir53-His175 во човечки карцином на бели дробови клеточна линија N1299ili глувчешки фибробластен линија 10 (1), со што се потврди svyazvyyavlennyh разлики во стапката на пролиферација ekspressieymutantnogo токму со p53, и не со било кој секундарни промени voznikayuschimiv резултат на континуирана селекција со егзогени mutantnymr53 клетки. Треба да се нагласи дека индукција на изразување на дивиот тип на p53 на мобилните контексти не доведе до намалување но да uvelicheniyuvremeni двојно зголемување на популацијата на клетки или апоптоза.

Забрзување на пролиферацијата на клетките под влијание на ново priobretennyhaktivnostey мутираниот p53 се должи, очигледно, нивната vozdeystviemna регулацијата на клеточниот циклус. Анализа на кинетиката на изглед mechenyhmitozov по додавање на 5-bromodeoxyuridine за 20 мин., Ние opredelyaliprodolzhitelnost одделните фази на клеточниот циклус на раст на logarifmicheskoyfaze. Се покажа дека вклучувањето на експресијата на мутираниот r53znachitelno го намалува времето за клеточниот циклус траење скратување schetsuschestvennogo S-фазата. Така mutantnyyr53 нема значително влијание врз времетраењето на drugihfaz клеточниот циклус.

Стекнатите мутираниот p53 активност, во прилог на izmeneniyregulyatsii на клеточниот циклус во нормални физиолошки услови, може да ги менувате G1-контролен пункт функција се активира povrezhdayuschimivozdeystviyami. Откривме дека индукција на изразување mutantnogor53-His175 клетки 10 (1) и H1299 води до фактот дека S-fazuvhodit 1,5-2 пати повеќе клетки со оштетување на ДНК, indutsirovannymialkiliruyuschim соединение етил метансулфонат (ЕМС), а потоа p53 дива kakekspressiya тип, напротив, се намалува процентот povrezhdennyhkletok вклучени во S-фазата. Во исто време, prakticheskine на p53-His175 влијае на активноста на контролниот пункт работат во G2.

Механизмите кои ги идентификувавме ефектите на стекнатите aktivnosteymutantnogo p53 во регулацијата на клеточниот циклус до neyasny.Naibolee веродостојно е претпоставката дека овие izmeneniyasvyazany со способноста на p53-His175 зголеми израз genamyc. Своите производи, како што е прикажано погоре, може, од една страна, ген на транс-активирање на орнитин декарбоксилаза, и повик, Така болест, скратување на S-фаза, а од друга страна го активирате kompleksytsiklin E / Cdk2 и откажете станица оштетените клетки во perehodeiz G1 на S .

Влијанието на новите активности на мутираниот p53 во индукцијата на апоптоза

Мутираниот p53 може да го менува ефектот на цитостатици, само izmenyayane регулатива G1-контролниот пункт, но исто така и ослабување на индукција apoptoza.Pri оваа нова активност на мутираниот p53 чин како naapoptoz предизвика оштетување на ДНК и апоптоза предизвикани од"смрт домен" ("смрт рецептори") Во медиум на култура posledobavleniya TNF-a или анти-Fas. Sleduetpodcherknut дека таквите ефекти од мутираниот p53 во големи stepenizavisyat на специфични супституции на амино киселина, како што апоптоза и евентуално мобилната контекст. Така, p53-His175, многу посилно отколку p53-Trp248 или p53-His273, го инхибира апоптоза предизвикана од страна на ДНК povrezhdayuschimivozdeystviyami (EMC, етопозид). Во исто време, p53-His273 посилно од p53-His175, потиснува на Fas-индуцирана апоптоза во рак на простата chelovecheskihkletkah линија PC-3. Покрај тоа, различни mutantnyer53 различно влијае на апоптозата индуцирана Fasi TNF-а.

Механизми на дејство на стекнатите активности во регулирањето на апоптоза mutantnyhr53 студирал до прилично лошо. Nedavnoobnaruzheno дека еден начин на таква регулатива може да yavlyatsyatrans BAG1-активирање на генот кој го кодира антиапоптотички beloksemeystva BCL2.

Влијанието на новите активности на мутираниот p53 со дрога на хемотерапија chuvstvitelnostk

Во прилог на не-специфични ефекти на чувствителност на tsitostatikamposredstvom промени во регулацијата на клеточниот циклус и апоптоза, novyeaktivnosti мутираниот p53 може да има повеќе spetsificheskoedeystvie чувствителноста на одредени лекови sredstvamputem промени во регулирањето на цели хемотерапија. Користење на хибридизација metodsubtraktivnoy идентификувавме непознат raneemisheni трансактивација на мутираниот p53 акција и ги најде дека една група на гени конкретно активира со мутираниот p53 генот вклучува кодирање деокси-UTP-иши. Функција dUTFazy zaklyuchaetsyav хидролиза на dUTP да шутнат и пирофосфат. За возврат, да се формира dUMP sluzhitsubstratom dTTP de novo. Се претпоставува дека povyshenieurovnya dUTFazy може да предизвика отпор на 5-флуороурацил, shirokoprimenyaemomu хемотерапевтски агенси, чиј механизам на дејство од страна на инхибиција на синтезата svyazans dTTP timidilatsintetazy.My преку потиснување на активност даде дека индукција на p53-His175 или p53-His248, како и воведување на конструкт изразување на UTP -azu, дури и во сите истражуваниот култури (карцином на бели дробови H1299, rakyaichnika Сков-3, фибробласти 10 (1) за да се 1,5-2 пати зголемен chislokletok во можност да формираат колонии по изложување на 5-флуороурацил a.Pri овој отпор на две различни лекови - metotreksatui адриамицин - не се зголеми во исто време на p53-His273, neobladayuschy способност за транс-активира генот UTP-иши не uvelichivalustoychivost податоци клеточна култура на 5-флуороурацил ..

Очигледно, постојат и други начини на кои мутираниот p53 активност vnovpriobretennye влијание chuvstvitelnostkletok на одредени цитостатици. Така, ние откривме дека vleykoznyh K562 клетки, за разлика од ќелија 10 (1) и сор., Изразување на p53-His175 предизвикува значително намалување chuvstvitelnostik метотрексат. Изразување на овој мутант неколку отпор uvelichivalatakzhe на леукемичните клетки да noprakticheski на винбластин акција не се промени на чувствителност на етопозид. Во исто време, изразот на p53-His273 не се намали, туку напротив, неколку povyshalachuvstvitelnost K562 клетки на метотрексат и винбластин. Mehanizmyetih ефекти остануваат нејасни.

Така, ние откривме дека стекнатите aktivnostimutantnyh p53 аминокиселински супституции на различни положби razlichnymobrazom влијае на чувствителност на различни цитостатици. Prietom може да се разликуваат не само ефектите на различни мутираниот p53 вода и на истиот тип клетки, но исто така и на дејството на истиот mutantav клетки од различно потекло. Сето ова е потребно uchityvatpri тековните обиди ispolzovatmutatsii p53 да се предвиди резултатите од антиканцер хемотерапија.